中图分类号:R378.21; Q93-336
微生物菌种的保存方法因微生物种类不同而有所不同,国内外对此有较多的报道[1～3].甘油保存法是生产中常用的方法之一.在甘油保存菌种过程中,细胞内外形成的冰晶会对细胞造成结构上的损伤,从而影响菌种的存活率.本文主要探讨了反复冻融对发酵用大肠杆菌甘油保存的影响.为制药和微生物工作者提供具有参考价值的数据.
1.材料
大肠杆菌PJLA605-HIL2.
LB固体培养基:胰蛋白胨(英国Oxoid)10 g、酵母抽提物(英国 Oxoid)5 g,氯化钠10 g,溶解并定容至1 000 ml,调pH至7.2,固体培养基加2%琼脂.
2.方法和结果
2.1大肠杆菌培养
将待分离的菌种划LB平板,以取得单菌落,经模拟发酵选出优良菌种,将此菌种接到LB斜面上,30℃,培养24 h.
2.2大肠杆菌冻存
用10%甘油溶液洗下培养好的菌种,并在无菌小烧杯中混匀,制成浓度为1×108个/ml的菌悬液,然后分装到eppendorf管中,每支eppendorf管加菌液1 ml,将此菌种分成3组,编号1、2、3,然后放入-20℃冰箱中保存.
2.3二次冻存
将2.2项中的第2、3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴锅中融化,然后再放入-20℃冰箱冻存.
2.4三次冻存
将2.3项中的第3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃的水浴锅中融化,然后再放入-20℃冰箱冻存.
2.5存活率的测定
采用平板菌落计数法.取LB平板9套,每3套为一组,在每组皿底分别标明10-7、10-8、10-9,再取9个2 ml西林瓶,依次标明10-1、10-2、10-3……10-9,并向西林瓶中各加入无菌水0.9 ml.
用微量取样器精确吸取第1组菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.将10-1西林瓶内的菌液混匀,即成10-1稀释液.再从10-1西林瓶中取稀释液0.1 ml注入10-2西林瓶中,重复上述操作,直至制成10-7、10-8、10-9稀释液.
分别精确取10-7、10-8、10-9稀释液0.1 ml注入对应的LB平板内,用玻璃涂布器涂布均匀,于30℃培养24 h后,数各皿中的菌落数,计算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数,根据菌落数计数活菌数.
用同样步骤可计算出冷冻前3组菌液的活菌数,见表1.
在冷冻后及冷冻后1年、2年分别将3组菌种从-20℃冰箱中取出,于28℃～30℃水浴锅中融化,用平板计数法测定活菌数,计算菌种存活率,如表1.
3.讨论
在冷冻保存菌种时加入甘油作保护剂,虽然可以提高菌种的存活率,但冻融还是会造成菌体结构上的损伤.菌种每冻融一次,其存活率都会明显下降,经处理后的菌种保存1年或2年后,冻融次数越多,其存活率越低.因此,为使菌种有较高的存活率,不宜反复冻融.生产用甘油菌种一般保存1年,对1年后的菌种就要对其筛选活化后再用.
参考文献
1,王亚珍.乳酸杆菌的保藏方法.生物技术,1998,8(1)∶41～42
2,李广武,郑从义,唐兵.低温生物学.长沙∶湖南科学技术出版社,1998∶130～131
3,中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编著组.菌种保藏手册.北京∶科学出版社,1980∶649～652
