M41 艰难梭状芽孢杆菌乳胶凝集试剂盒（M41 MICROSCREEN®C. DIFFICILE）

一、用途

艰难梭状芽孢杆菌乳胶凝集检测试剂用于确证鉴定从假膜性结肠炎、与抗生素有关的腹泻和手术后腹泻病人的粪便样品中分离出的艰难梭状芽孢杆菌可疑菌落。该试剂盒仅供专业人员使用。

二、原理

乳胶颗粒表面包被与艰难梭状芽孢杆菌细胞壁抗原具有特异性的兔免疫球蛋白抗体。当敏化的乳胶颗粒与艰难梭状芽孢杆菌菌悬液混合后，敏感而特异的免疫化学反应可使乳胶颗粒迅速形成肉眼可见的凝集。

三、试剂盒组成成分

REAG TEST 测试试剂　Mvalue="41" unitname="a">41a 艰难梭状芽孢杆菌乳胶试剂　2.5mL

乳胶颗粒包被与艰难梭状芽孢杆菌抗原具有特异性的兔免疫球蛋白。含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（蓝色瓶盖）

ConTROL +  阳性对照试剂　M41b　阳性对照　　0.5mL

不具活性的艰难梭状芽孢杆菌抗原，用于与测试试剂反应。含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（黑色瓶盖）

NaCl 0.85%  0.85%盐水　M40　0.85%生理盐水　5.0mL

含0.099%的叠氮化钠防腐剂。（白色瓶盖）

使用说明书

检测板

搅拌棒

需要的其它材料

l         接种环

l         梭状芽孢杆菌的选择性分离平板（CCFA或CCEY）

四、警告和注意事项

安全：

1、试剂仅供体外诊断使用。

2、试剂盒作防腐剂使用的叠氮化钠可与铅或铜制品反应形成易爆的金属叠氮化物。可用大量水冲洗以避免叠氮化物的堆积。

3、在处理或检测可疑致病菌时应采取适当的预防措施。被污染的物品可用3%的次氯酸钠消毒处理30分钟。含酸的废液应作中和处理。

4、阳性对照液在生产中已作惰性处理，但仍应遵循潜在传染性产品的处理程序。

检测过程：

1、试剂盒应按说明书使用。

2、所有试剂在使用前应达到室温。

3、不要稀释试剂盒内的任何试剂

4、不要混合不同批次试剂盒的试剂。

5、不要冷冻试剂盒内的试剂。

6、不要使检测乳胶试剂的滴管接触到阳性对照试剂或细菌样品。

7、使用前应确保检测板清洁干燥。

8、如果阳性对照不发生凝集或乳胶试剂在生理盐水中自凝，说明试剂已无效。应使用新的试剂盒。

五、贮存及保质期

检测试剂盒不使用时应贮存在2～8℃，并应在包装盒标签上的有效期内使用检测试剂。

六、样本

粪便样品应接种于增菌肉汤中在37℃培养18～24小时后，然后在选择性平板（CCFA或CCEY）上培养增菌液。平板应在厌氧环境中37℃培养24～48小时。

挑取选择性分离平板上的艰难梭状芽孢杆菌可疑菌落，用该试剂盒进行检测。（程序如下）

七、检测过程

质量控制：

在每次使用检测试剂盒前应作下列质量控制检测，以确证试剂的有效性。

1、检测试剂的控制：滴加1滴生理盐水(M40)于一个测试反应环内，然后在同一反应环内滴1滴测试试剂(Mvalue="41" unitname="a">41a)，再用搅拌棒在整个区域内混匀液体，并观察是否会出现凝集。应无凝集发生。如果出现凝集反应，表明检测试剂或生理盐水受到污染，应废弃处理。

2、阳性对照的控制：轻轻摇匀阳性对照试剂(Mvalue="41" unitname="a">41a)，并滴1滴于测试反应环内，然后滴1滴测试试剂(Mvalue="41" unitname="a">41a)于同一个测试反应环内，再用搅拌棒混匀液体， 2分钟并观察凝集。如果未出现凝集反应，则应废弃该检测试剂盒。

测试程序：

1、滴1滴生理盐水(M40)于洁净的检测板上的一个反应环内。

2、用接种环从选择性分离平板上挑取可疑菌落，与反应环内的生理盐水混合，形成均匀的菌悬液。

3、观察菌悬液是否会出现自动凝集现象。如果出现自凝现象，即不可用乳胶试剂检测该菌株。应选用其它的检测方法。如果没有出现凝集，进行下一步测试。

4、轻轻摇匀乳胶测试试剂后，滴1滴至反应环内的菌悬液中，不要使检测乳胶试剂的滴管接触到菌悬液。

5、用1支干净的搅拌棒混合菌悬液和测试试剂约30秒，然后轻摇检测板。

6、在2分钟内观察凝集结果。

7、记录结果后，将搅拌棒和检测板进行适当的消毒处理。

八、结果说明

在2分钟内出现凝集，表明样品中有艰难梭状芽孢杆菌，如不出现凝集，表明测试菌落中无艰难梭状芽孢杆菌。

九、使用的局限性

1、结果应依据所有的临床和实验室信息进行判断。分离出艰难梭状芽孢杆菌不能确诊假膜性结肠炎或抗生素性腹泻。

2、使用乳胶试剂检测艰难梭状芽孢杆菌时应选取选择性平板上可疑菌落，以提高分离率。

3、其它的梭状芽孢杆菌偶尔也可在CCFA平板上生长，但它们在CCEY平板上的菌落形态与艰难梭状芽孢杆菌不同，或不生长。

4、分离出的可疑艰难梭状芽孢杆菌发生自凝现象时，不可采用乳胶试剂检测，应选用其它方法检测。

十、检测效果对比

在一个独立的英国微生物实验室和和公司内部均分别对Microscreen 艰难梭状芽孢杆菌乳胶试剂盒与一种已广泛使用的商业化的乳胶试剂盒做了测试效果对比。用二种商品共检测137株在选择性平板上生长的菌落。

灵敏度　185/85＝100%

特异性　52/52＝100%

一致性　137/137＝100%

^＊检测样品中分离出的85株，其中18株在二种试剂盒中均存在交叉反应，但其中的16株不会在艰难梭状芽孢杆菌的选择性平板中生长或其生长时菌落形态与艰难梭状芽孢杆菌不同。另外2株（均为C.glycolicum）在其平板上可弱生长，但菌落不具有大多数艰难梭状芽孢杆菌所特有的荧光。

^＊＊其中有2株艰难梭状芽孢杆菌（血清型A9、A10）。其中1株（A10）显示出轻微异常的菌落形态，其余的50株包括不同种的细菌，其中5株为梭状芽孢杆菌属。大部分单个菌落不会在艰难梭状芽孢杆菌的选择性平板上生长　或生长时显示出非典型的可疑菌落。

测试结果显示Microscreen乳胶凝集检测试剂盒与这种已广泛使用的商业化的乳胶试剂盒检测效果相当。尽管少量菌株在2种试剂盒中均存在假阳性结果，但在艰难梭状芽孢杆菌的选择性平板上，不会生长或菌落形态不同。　

  总的来说，用Microscreen艰难梭菌乳胶凝集检测试剂盒检测结果与所对比的另一商业化产品结果一致。

十一、重复性

批内重复性：通过以系列稀释度的参照抗原和试剂盒对照抗原及一组质控菌株对同1批产品的灵敏度和特异性进行检测。由不同的操作者随机测试3次，3个操作者间分析结果无显著差异。