聚丙烯酰胺凝胶电泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分离,最常用于蛋白质的分离,这里总结了DNA电泳的各种浓度PAGE胶配制的配方及制备方法。
聚丙烯酰胺 凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。
各种浓度PAGE胶的配制(DNA电泳用)
50ml体系:
丙烯酰胺 | 有效分离(bp) | 二甲苯青 | 溴酚蓝 | 丙烯酰胺30%(ml) | 10×TBE(ml) | ddH2O(ml) | TEMED(µl) | 过硫酸铵10%(µl) |
3.5% | 100-1000 | 460 | 100 | 5.83 | 5 | 39.17 | 25.0 | 250 |
5.0% | 100-500 | 260 | 65 | 8.33 | 5 | 36.67 | 25.0 | 250 |
8.0% | 60-400 | 160 | 45 | 13.33 | 5 | 31.67 | 25.0 | 250 |
12.0% | 40-200 | 70 | 20 | 20.0 | 5 | 25.00 | 25.0 | 250 |
15.0% | 25-150 | 60 | 15 | 25.0 | 5 | 20.00 | 25.0 | 250 |
20.0% | 5-100 | 45 | 12 | 33.33 | 5 | 11.67 | 25.0 | 250 |
5ml体系:
丙烯酰胺 | 丙烯酰胺30% | 10×TBE | ddH2O | TEMED | 过硫酸铵10% |
3.5% | 0.583 | 0.5 | 3.917 | 2.5 | 25 |
5.0% | 0.833 | 0.5 | 3.667 | 2.5 | 25 |
8.0% | 1.333 | 0.5 | 3.167 | 2.5 | 25 |
12.0% | 2.00 | 0.5 | 2.5 | 2.5 | 25 |
15.0% | 2.50 | 0.5 | 2.0 | 2.5 | 25 |
20.0% | 3.333 | 0.5 | 1.167 | 2.5 | 25 |
1、丙烯酰胺30%为29:1(质量比,丙烯酰胺:双甲叉丙烯酰胺)
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
丙烯酰胺(%) | 有效分离范围(bp) | 溴酚兰* | 二甲苯青* |
3.5 | 100~2000 | 100 | 460 |
5.0 | 80~500 | 65 | 260 |
8.0 | 60~400 | 45 | 160 |
12.0 | 40~200 | 30 | 70 |
15.0 | 25~150 | 15 | 60 |
20.0 | 10~100 | 12 | 45 |
*表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子 所含碱基对数目(bp).
凝胶的制备过程:
1、 按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60°。
3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。
4、 加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液体接近溢出时为止。
5、 立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使成10°角,可减少液体泄漏的机会。
6、 室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE缓冲液。
7、 小心取出梳子,加样。
大家可以根据自己试验中DNA片段大小的不同选择配制合适浓度的丙烯酰胺胶。PAGE胶配制过程中记得避免气泡的产生。