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RNA提取及注意事项(二)

   2024-01-31 网络核心提示: DEPC(二乙基焦碳酸酯)(1)D902
核心提示: DEPC(二乙基焦碳酸酯)(1)DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。(2)DEPC与……(世界食品网-www.shijieshipin.com)
 DEPC(二乙基焦碳酸酯)

(1)DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

(2)DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

(3)试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度然后剧烈振荡10分钟再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。

(4)但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

实验步骤如下:

1. 取50~100mg的组织加入1 ml Trizol试剂,用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。

2. 将匀浆室温放置5 min。

3. 加入200 μl 氯仿剧烈震荡混匀30s,冰上静置3 min。

4. 12000 rpm,4℃ 离心15 min。

5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中(取400 μl ),加入等量体积的异丙醇,上下颠倒几次混匀,室温下放置15 min。(此步中留意:不要吸取任何中间层物质,宁缺勿滥。)

6. 12000 rpm,4℃ 离心15 min 。

7. 小心移去上清液,防止RNA沉淀丢失。

8. 用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次,加入700 μl乙醇,将RNA沉淀弹起,漂洗。(此时RNA是不溶解的)

9. 8000 rpm,室温离心10min。

10. 尽可能彻底地吸走上清,防止RNA沉淀丢失。

11. 真空离心干燥3~5分钟,或放在室温下使乙醇完全挥发掉。

12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶,68 ℃处理10 min。

13. RNA检测

(1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0 。

(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确定RNA的完整性和污染情况。

低得率:A.样品裂解或匀浆处理不彻底;B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。





 
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