检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:
1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);
2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;
3、引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;
4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;
5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
二、ct值过晚
在相对定量中, Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品,Ct值会增大, 但是一般不宜超过40循环, 否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化;引物或探针设计不合理, 需要重新设计;
2、PCR程序不合适, 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度; 退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);
3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;
4、PCR产物太长。PCR产物设计超过500bp;
5、模板中存在抑制物。用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
三、阴性对照扩增有信号
照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
2、引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比；
3、镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒；
4、模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增；
5、交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
四、标准曲线不佳
标准曲线线性关系不佳R2<0.9,很有可能是以下环节存在问题:
1、标准品稀释或者加样误差,使得标准品不呈梯度;
2、标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,现配现用;
3、引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针;
4、模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量以50—500ng为宜。
五、熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:
1、引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现; 引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例;
2、模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增；
3、离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的mix试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。
六、扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题:
1、模板的浓度太高或者降解;
2、荧光染料的降解;
3、在操作荧光定量PCR时,带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等;
4、液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;
5、气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
七、扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:
1、反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解;
2、反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间;
3、反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。
