SPE常见操作的背后原理_通用实验室仪器_仪器设备

1、为什么SPE小柱操作要强调流速？

答：SPE小柱的填料装填压实以后，形成柱床，当溶剂流过小柱，速度过快将导致两个问题，一个问题是对于键合相填料，由于流速快而使得其不能充分浸润舒展，因而导致其保留活性降低；其次过快的流速导致小柱可能形成沟渠，使得填料未被充分浸润，降低了吸附填料与样品的接触面积，影响了目标物质的传质过程，因而导致回收率降低。对于0.5-3.0mL/min的小柱流速通常是不会产生沟渠效应的，另外沟渠的形成与柱床高度有关，对于薄膜型的萃取膜片或者膜盘，由于横截面大，柱床低，在高流速下不会导致严重的沟渠效应，因此适合在高流速的大体积水样的富集，对于离子交换和特异性吸附，填料和分析目标物的相互作用时间比常规小柱长，流速的控制，确保了好的保留效果。

沟渠效应：

SPE小柱的填料装实后，当通过小柱的流速较低时，液体是以层流的方式通过填料层，将填料层浸润充分，湿润的液面截层逐级向前推进，见附图；当流速过大的时候，而柱床厚度较高时，可能会在填料内部形成沟渠通道，液流将通过沟渠，快速通过小柱，而使得填料的浸润变得不充分，这样将使得体与填料的接触面积大大降低，严重影响填料对目标物质的保留效果。

2、溶剂环境的pH怎么影响化合物在小柱上的保留，为什么我们要关注化合物的pKa值，在C18小柱中需要考虑这些因素吗？

答：首先我们来说一下，Ka指的是酸度系数，又名酸离解常数，可以理解为酸离解H离子的能力，而pKa=-lgKa，对于酸，在环境pH下存在如下平衡：

左边的A-/HA，实际是指溶剂环境下，离子态和分子态的比例，右边反映了左侧两者的转化关系，取决于（pH-pKa)的数值大小。对于离子交换小柱，保持目标物的离子化而非分子态，是一个关键点，这对于离子交换作用机理的交换柱，将直接关系到其实验成败。而对于硅胶键合C18小柱的萃取，由于硅胶（—SiOH）不能完全“封端”，在pH大于4.0的情况下，硅胶都会带上负电荷，因而会使得能电离的化合物与硅胶作用，增强了这种附带的次级作用理（主作用力为非极性相互作用力），而使得此类物质在硅胶-C18上的保留增强，若只考虑C18的非极性作用力，必然会导致回收结果的不尽人意。

3、中性氧化铝，酸性氧化铝、碱性氧化铝，怎么区分？

答：Al2O3 的主要作用力是通过金属铝中心与化合物的羟基形成氢键来吸附，或者通过离子交换作用。中性氧化铝（Al-N）：pH为6.5，中性氧化铝主要通过铝原子中心与带有高负电荷的杂原子作用，如：N、O、P、S及富电子的芳香族化合物。

先理解酸化后和碱化后的氧化铝，氧化铝的性能变化：

Al2O3 + 6HCl = 2AlCl3 + 3H2O；

Al2O3 + 2NaOH= 2NaAlO2(偏铝酸钠) + H2O

酸化的氧化铝和碱化的氧化铝，使得氧化铝表面的电荷性发生改变，如酸性氧化铝带正电荷的中心容易吸附阴离子，并且产生偶极作用，吸附极性化合物；而碱性则吸附极性和含阳离子官能的化合物。

4、为什么在农残检测过程中GCB常见于净化模式，而不用于富集模式？

答：SPE的净化模式常被用来吸附杂质，而富集模式常被用来吸附目标物质，GCB是一种石墨化碳黑，是将炭黑在惰性气氛下加热到2700-3000℃烘焙而成，它由六个碳原子构成平面六角形，并且层叠而成，对于芳香平面分子，很容易嵌入，而具有较强吸附芳香化合物的选择性，对于其他分析物也有较好的吸附性能，填料的吸附与解吸附的性能将直接影响填料的使用范围，对于GCB而言，其吸附性能较强，但是解吸附的可逆性稍差，需要选择合适强度的溶剂来释放被吸附的物质，因而造成了解析溶剂匹配较为困难，由于其对色素等的优秀吸附性能，因而在农残样品处理中，常用来吸附色素等杂质，而不是选择用来保留目标化合物。

5、HLB小柱为什么与传统的硅胶键合C18不一样，厂商建议可以不活化平衡？

答：SPE小柱活化平衡的目的有两个，一是使得键合官能团填料的湿润和舒展，使之保持对目标化合物的最大吸附活性，另外一个目的就是去除填料本身可能引入的杂质。我们知道硅胶键合C18，是在硅胶微球表面键合疏水性的C18官能团，为了使得其保持对目标物的充分的吸附活性，需要在湿润的环境上样，在填料表层形成的液膜（活化平衡）和上样的溶剂分子有良好的相容性，目标物在膜间进行传质，与键合C18发生疏水作用而保留，C18本身不具备水浸润性，直接上水样，C18蜷缩，而且强的疏水性导致其与溶剂中的目标物质接触传质变得困难，因此活化平衡必不可少，HLB小柱采用聚合物改性材料，增加了亲水基团，使得在上样溶剂时就能很好的和水溶剂互溶，因而填料的官能团能在上样溶剂的环境下就与目标物分子充分接触，而发生传质，使得目标物质被充分保留住。

6、淋洗步骤通常需要干燥，这个原因是什么？

答：淋洗液通常要干燥，主要作以下考量：

（1）通常由于反相萃取在化合物的前处理中使用的比较多，正如反相色谱在色谱中作为常见的分离方法一样，在反相萃取中的淋洗液常为水相或者含水的缓冲溶液，去除水份，可以便于后续干燥浓缩步骤。

（2）有的项目，在淋洗步骤完成后，直接用一定体积的洗脱液，比如1ml的甲醇洗脱，此过程将洗脱与定容集为一步处理，前一步的处理必然对洗脱步骤的定量结果产生影响。

（3）便是溶剂互溶问题，当淋洗步骤使用的溶剂极性与洗脱溶剂的极性差异较大时，会产生乳化分层，洗脱阻力大，洗脱液被稀释的风险等，导致洗脱效果的差异，以致于实验结果的失败。

7、我们在使用硅胶键合填料类型的色谱柱的时候，出于对色谱学的常识，知道了硅胶键合填料一般厂商建议的pH使用范围为2-8，那么对于使用硅胶键合的填料的固相萃取小柱，是否需要严格遵守这样一条规定？

答：首先，我们需要了解到，厂家建议的pH2-8的耐受范围，是为了保证色谱柱的正常使用寿命，硅胶键合相在超出耐受的pH范围使用，会导致键合相与硅胶基质的断裂，因此会损害色谱柱柱效和保留特性，但是我们知道这个pH耐受值范围外的溶剂对于色谱柱的影响，主要是一个积累性的过程，在溶剂冲刷下，逐渐溶解而导致色谱柱性能改变和不可逆，寿命减短。

SPE小柱和色谱柱的一个差异就是，SPE是一次性消耗品，在耐受的溶剂范围外，短暂时间的溶剂冲刷对于小柱的保留特性影响甚微，并不会导致其保留显著差异，因此其使用的pH范围更宽，一般可以在pH值范围1-10使用，而不会导致其结果的差异性。