蜂蜜中四环素类药物残留检测的固相萃取方法
（Copure® HLB）
一、实验目的
本研究利用固相萃取作为样品前处理方法，HPLC作为分析方法，检测蜂蜜样品中四环素类抗生素的残留水平。该方法操作简便，可简化样品前处理过程，减少有机溶剂的使用。
二、实验目标物
土霉素(CAS:79-57-2)，四环素（CAS: 60-54-8）。
三、应用范围
本方法适用于蜂蜜中四环素类的固相萃取及HPLC检测与确证。
四、参考标准
《GB/T 21317-2007 食品安全国家标准 动物源性食品中四环素类药物残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》。
五、实验材料
Biocomma® Copure® HLB固相萃取柱60mg/3mL(Cat.No.COHLB360)。
六、实验方法
1、样品提取
称取混匀蜂蜜试样5 g(精确到0.01 g)，置于50 mL离心管中，用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲液溶解并定容至50 mL，漩涡混合1 min，冰水浴超声10 min，转移至50 mL离心管中，冷却至0 ℃-4 ℃，5000 r/min离心10min(温度低于15 ℃)，用中速滤纸过滤待净化。
2、SPE柱净化
(1)活化：HLB柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化。
(2)上样和洗脱：准确吸取10 mL备用液以1滴/秒的速度过HLB固相萃取柱，待样液全部流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇-水(5:95, v/v)淋洗，弃去全部流出液。2.0 kPa以下减压抽干5 min，用10 mL甲醇-乙酸乙酯溶液(1:9, v/v)洗脱，收集洗脱液。
(3)重新溶解：洗脱液于40 ℃氮气吹干，加10 mmol/L三氟乙酸水溶液1.0 mL溶解残余物，滤膜过滤，供高效液相色谱测定。
3、HPLC条件
设备：Waters Alliance 2690
色谱柱：Welch Ultimate XB-C18 (4.6X250 mm)
检测器：Waters 2487 紫外检测器
检测波长：350 nm
流动相：A: 乙腈 B:10mmol/L三氟乙酸水溶液
洗脱方式：梯度洗脱
表1 梯度洗脱条件
流速：1 mL/min
柱温：室温
进样体积：20 μL
七、实验结果
1、蜂蜜基质中添加1mg/kg四环素的回收结果
表2 蜂蜜基质中添加1mg/kg四环素的回收结果
2、 添加水平为1mg/kg蜂蜜中四环素检测色谱图
图1 添加水平为1mg/kg蜂蜜中四环素检测色谱图
