过氧化氢灭菌验证的问题
过氧化氢灭菌效果的要求
灭菌是指杀灭细菌及其细菌繁殖体、芽孢、病毒和真菌孢子等形式的微生物的过程。它是不能由随后的产品检验和试验来充分证实其结果的特殊过程[1]。上，为了量化“无菌”的标准，提出“无菌保证水平”的概念，并以此来评价灭菌的杀灭效果。我国及欧美药典都将无菌保证水平值不大于百万分之一作为终灭菌产品的无菌保证要求。
关于过氧化氢蒸汽灭菌的灭菌效果的要求，国内外对此一直争论不休。通常而言，上将过氧化氢蒸汽的净化处理过程视为“除染”，而不是“灭菌”。因此，要求过氧化氢蒸汽的灭菌效果达到终灭菌产品的灭菌要求似乎是不太明智的。正是如此，不难发现在权威的相关法规和指南上，如表1所示，过氧化氢灭菌效果的要求不是要求该工艺的无菌保证水平值低于SAL(10-6)，而相替代的是达到孢子对数降值为6 SLR是足够的。
就应用过氧化氢蒸汽灭菌技术于隔离器或其他设备的而言，“美国注射药物协会”(PDA)第34号技术报告提到：“不与药品直接接触的部件或设备的灭菌要求与直接和药品相接触的部件或设备的灭菌要求是不相同的。通过完全杀灭具有较强抗性的孢子量为103的生物指示剂(相当于杀死5-log或更高的灭菌水平)，能足够保证隔离器内部没有可检测的微生物”[2]。而“美国食品及药物管理局”(FDA)则推荐到，应用过氧化氢蒸汽对无菌制药领域的隔离器进行灭菌，其灭菌能力达到4~6log是比较合适的[3]。
就过氧化氢灭菌水平要求而言，作者认为除了考虑无菌保证水平外，还应考虑实际应用条件、人员安全、环境破坏及灭菌验证方法等条件。目前，过氧化氢蒸汽灭菌应用的场合有洁净室、实验室、疾控中心、航天飞机舱、救护车、传递窗、隔离器、生物安全柜等区域，而这些区域的内部表面并未与药品或产品直接接触。而在应用过氧化氢蒸汽对这些区域进行灭菌的验证过程中，要求该灭菌工艺的非无菌单元概率值(PNSU)低于千分之一是可以接受的。
但是，仅要求过氧化氢蒸汽灭菌处理的效果致使挑战生物指示物的孢子对数降值为6 SLR是远远不够的。对于不同灭菌场合或灭菌区域而言，初始生物负载水平参差不齐。而且，也难以保持初始生物负载水平稳定。因此，就特定区域进行过氧化氢蒸汽灭菌的灭菌验证而言，如果初始生物负载的数量及抗性超出预期，那么，终的非无菌单元概率值(PNSU)是远远高于无菌保证水平值的。
生物指示剂
就挑战微生物而言，2010版中国药典[4]提到，过氧化氢蒸汽的灭菌验证的生物指示剂的挑战微生物常选择嗜热脂肪芽胞杆菌的孢子。不仅是因为该类微生物对过氧化氢蒸汽显示相当强的抗性，而且还因该类微生物可有效地减少交叉污染的风险(培养温度在55~60℃)。正是如此，市面上的用于过氧化氢灭菌验证的生物指示剂大多数都选择该细菌孢子作为标准挑战微生物。
目前，就挑战所选择的生物指示剂的孢子量的问题，国内外尚有很多争议。作者认为在微生物致死过程遵循一级动力学的前提下(换言之，过氧化氢的灭菌致死性与挑战微生物数目无关)，过氧化氢灭菌效果的确定与孢子量之间没有必然的联系。过氧化氢蒸汽灭菌工艺的灭菌能力是由“灭菌验证方法”所决定的。因此，而为了达到6 SLR的灭菌要求，没有必要选择孢子量为10^6的生物指示剂进行验证。
据研究发现，在同等过氧化氢灭菌条件作用下，相比具有同种孢子但孢子量较低的生物指示剂，较高孢子量的生物指示剂的抗性要高一些[13]。因此，如果选择较高孢子量的生物指示剂进行灭菌工艺开发所获得的灭菌循环是相对“保守”且“过度”的。
市面上适用于过氧化氢蒸汽灭菌验证和监测的生物指示剂多种多样，它们的主要不同之处在于其基底载体的差异。有的是用纸条做载体、有的是玻璃纤维，有的是不锈钢片等等。一些学者认为，鉴于过氧化氢所灭菌区域的表面材质差异，因此应选择目标灭菌区域抗性的材质作为挑战指示剂的基底材质。尽管在不同基底材质上的生物指示物的抗性有所差异。但是，事实证明，以所谓的“差”基底材质进行灭菌工艺开发所获得的灭菌效力与以其他基底材质所获得的结果没有多大的差异。而真正问题的实质在于生物指示剂上的孢子相对于在生物负载的抗性差异。
无容置疑，生物指示剂供应商应提供该指示剂的相应的菌种数目稳定性及抗性数据(D值)。如图1所示，为1999~2005年间Apex实验室公司所生产的生物指示剂的标签上标注的D值与实际应用所测量的D值的对比图[5]。由此可知，生物指示剂供应商所提供的D值数据与实际复核测试所得结果有很大的出入。就指示剂的抗性复核测试而言，即使在生物指示剂供应商同样的灭菌条件下进行抗性测试，但由于与供应商测定的方法的不同或者过氧化氢灭菌设备的差异，终测试所获得的抗性结果可能与指示剂供应商所提供的D值仍有所差异。那么对生物指示剂的抗性数据进行测试的意义何在?作者认为，对每批的生物指示剂进行抗性测试和孢子计数是比较严谨的做法，通过此测试可追溯并评价不同批次的生物指示剂的抗性差异，并为再验证的灭菌能力的评估提供参考。
挑战位点
就过氧化氢蒸汽灭菌验证而言，灭菌的不利位点的确定是灭菌工艺开发和灭菌验证的关键所在。然而，在目前可获得的方法中，很难科学直观的确立过氧化氢灭菌的不利条件和位置。正是如此，在过氧化氢气体较难扩散的位置处放置足够多的生物指示剂以进行灭菌挑战也是无奈之举。
近年来，有不少案例报道了通过物理参数实时评估(诸如温度分布、湿度分布、烟雾测试及浓度分布)及“计算机工程模拟技术”(CFD)对过氧化氢蒸汽灭菌的不利位点进行研究。但是，其高昂的成本，复杂的数据分析让众多热衷于过氧化氢灭菌应用的终端使用者望而生畏。因此，通过分布较多的生物指示剂和化学指示剂进行工艺挑战以确定灭菌不利位点和灭菌致死率是比较主流的验证方法。
就生物指示剂挑战位点的数目而言：PDA第34号技术报告中提到，在隔离器腔体内部空间内，每平方米放置5~10个的生物指示剂是足够的。为了确认灭菌剂是否充分分布整个腔体，生物指示剂需充分分散放置在隔离器的表面上[2]。James Agalloco和James Akers[6]提到，就大型系统设备或区域而言(大于4m3)，至少需要30个生物指示剂放置位点以进行灭菌验证，而就较小的体积的灭菌区域而言(小于1m3)，10~15个生物指示剂验证位点是比较合适的，而体积大小介于两者的情况，25~30个生物指示剂是足够的。
灭菌工艺开发
的过氧化氢灭菌设备或系统的供应商都可提供相应的灭菌工艺开发的辅助服务。然而，在国内众多的过氧化氢灭菌应用案例中，“灭菌工艺开发”过程常被忽略并以所谓的“内部经验”取而代之。
不管选择何种灭菌剂或灭菌设备，以科学的测试方法评估和规范日常灭菌操作程序，并以此终确立稳健的日常灭菌参数的过程是非常必要的。而灭菌工艺开发正是该规范化过程，目前，传统的主流灭菌工艺开发流程如下：a. 初始生物负载评估与分析：确立灭菌目标;b. 温度分布、气流分析、关键区域评估等：确立灭菌不利位点;c.化学指示剂分布、浓度分布、气流模拟等：确立气流分布特征;d.参数设置与D值测试：确立灭菌致死率和灭菌参数;e.参数优化与确认：灭菌挑战与性能确认;f. 通风与残留：安全评估。
许多学者主张使用“阴性分数法”以确定过氧化氢灭菌循环的灭菌致死率。执行阴性分数法的前提是保证灭菌工艺稳定，并且要求关键灭菌作用条件恒定。然而，对于现行的过氧化氢蒸汽灭菌工艺而言，在灭菌过程中，控制过氧化氢的气液平衡是非常困难的。因为，在灭菌过程中，温度，相对湿度、过氧化氢气体浓度、压力及过氧化氢凝结等都是不断变化的。正是如此，FDA并不十分支持此类通过测定D值以确立灭菌致死性能的做法。但是，而使用类似于在环氧乙烷灭菌验证中所用的“半周期法”以建立的过氧化氢灭菌循环时间的提议更是非常不可取的。因为通过此法所确立的灭菌循环的灭菌循环周期非常长。此外，由此方法所产生的安全和经济问题也是不可预知的。
虽然，严格控制过氧化氢关键灭菌变量在恒定的水平是不太现实的。但是，在相同的灭菌设备和灭菌区域、相同的灭菌环境及相同的灭菌参数条件下，获得一致的“灭菌作用模式”不是不可能的。现行的报告或文章提到，过氧化氢蒸汽灭菌过程是一个受多参数影响的物理及化学综合作用过程，其灭菌效力主要受过氧化氢浓度、温度、相对湿度、表面的过氧化氢的凝结量影响[7]。因此，可通过控制过氧化氢蒸汽灭菌过程的气流参数以获得相对一致的“灭菌作用模式”。
尽管灭菌环境条件(温湿度)本身控制难度大，但是相关学者及相关论著提到环境条件本身对VPHP工艺的影响不是很大。Unger[8]等人较早对影响过氧化氢的杀孢子能力的灭菌条件进行研究，结果表明，汽态过氧化氢对微生物灭活的主要因素是在灭菌过程中在微生物表面所分布的水和过氧化氢分子，而气体中的过氧化氢浓度并不起关键性作用。
为了克服因灭菌工艺波动或者设备变数所造成的灭菌性能差异，许多学者建议在灭菌工艺开发所得到的灭菌暴露时间基础上增加20%。据2001 年ISPE所统计，在应用过氧化氢蒸汽对隔离器进行灭菌的483个案例中，通过使用孢子量为10^6的生物指示剂所验证的灭菌工艺都是合格的[9]。
“再验证”的注意事项
灭菌是保证无菌作业设备或系统的无菌性能的一个重要步骤，可通过使用生物指示剂对灭菌效果的再确认。如果在再验证过程中所使用的生物指示剂的抗性比“前验证”的生物指示剂抗性高，尽管灭菌工艺并没有改变，然而仍有可能会得到非预期的灭菌失败的结果。因此，在进行再验证之前，对挑战测试的生物指示剂的抗性进行测试和评估，并因此对灭菌的预期目标(期望)进行相应的调整，然后再执行再验证是比较科学的做法。
过氧化氢灭菌应用的相关问题
材料兼容性与腐蚀
作为一种强化学作用的化学物品，过氧化氢的腐蚀性一直是一个“老生常谈”的问题。除尼龙、碳钢、环氧树脂彩钢板、塑钢以及部分橡胶(乳胶橡胶、丁腈橡胶、氯丁橡胶等)等材料外，过氧化氢蒸汽可与大多数材料良好兼容。
在某些特定条件下，过氧化氢凝结的多少和作用时间的长短影响着灭菌的效果。但是，高浓度的过氧化氢凝结及作用时间关联着灭菌表面材质的腐蚀问题。故在灭菌工艺的开发过程中，需要权衡和协调凝结量(时间)与灭菌效果的平衡。而采用过度杀灭法所确立的灭菌循环的作用时间和剂量都远远超出实际所需，正是如此，因过度灭菌所给材质带来的腐蚀或者影响是大大增
加的。
残留与安全
许多过氧化氢灭菌系统的使用者都比较担心过氧化氢的残留对人、工艺、产品及使用设备的影响，因此要求对过氧化氢灭菌残留进行验证。作者认为，对于在与药品直接接触的材料的灭菌剂残留而言，残留水平是必需鉴定的。然而，就不与药品直接接触的表面进行净化处理而言，一定限度的过氧化氢残留并非会对依赖于产品特性的“无菌作业”产生多大的影响。因此，不必“过分纠结”在不与药品直接接触的材料上过氧化氢
残留。
就职业危害和人员安全而言，现行的美国职业安全及健康管理署对过氧化氢的“允许暴露浓度值”要求为8h“加权平均值”低于1ppm(或表述为1.4 mg/m3)。与此类似，美国国家职业安全与健康研究所推荐过氧化氢的“暴露浓度值”要求为10h(40h/周)“加权平均值”低于1ppm。此外，就污染安全排放标准而言，美国国家工业卫生学家会对过氧化氢的“污染排放临界值”定义为1ppm。
对于那些残留灭菌剂会阻碍微生物生长的使用环境，上述的残留限度要求是比较合适的。上一些药企也对过氧化氢的残留问题进行了较为细致的研究，他们所使用的检测仪器可以对极低浓度的过氧化氢进行
检测。
然而，就仅进行无菌作业及过氧化氢工艺本身不与人员直接接触(被隔离器屏蔽)的环境而言，过氧化氢气体的残留限度值低于5ppm是可以接受的。因为在仅进行不与无菌注射药品直接相接触的无菌作业的环境下，该限度水平下的的残留不会对产品产生影响，而且在8h的通风过程中，过氧化氢残留量随时间逐渐下降。
灭菌区域内表面的结构材质可能是导致通风时间较长的罪魁祸首。诸如PVC、Perspex、聚乙烯等材质可吸收过氧化氢，从而致使通风过程非常缓慢。在某种程度上而言，通过增加风量和换气次数的做法对通风排残效率的提高有一定的作用。但是对吸附有过氧化氢的材质而言，脱气和排残效果有限。因此，限制过氧化氢灭菌的作用时间可以减少此类材质对过氧化氢的吸收，从而提高灭菌效率并减少灭菌剂
残留。
无菌维持与灭菌间隔
在使用过氧化氢蒸汽对待灭菌区域进行“除染”处理后，使用诸如环境压差控制或其他环境控制技术对该净化环境进行无菌维护是非常必要的。其中需要注意的是“除染”与“灭菌”有所差异，经除染处理的灭菌表面并非与药品直接接触(不用注射到病人体内)。因此，过度要求经过氧化氢蒸汽灭菌处理后的所有灭菌区域达到无菌要求是没有任何意义的。
如何确定不同灭菌批次间的灭菌间隔是当前过氧化氢灭菌应用的另一个重要的问题。灭菌间隔的时长与灭菌区域内的日常活动、无菌维持及环境控制等因素有关。众所周知，应用于无菌制药工业的灌装隔离器的无菌要求是比较重要的，下面就该隔离器的无菌维持和灭菌间隔的时间确定方法进行举例说明。
传统做法是通过在预期的生产活动期间内进行培养基模拟灌装，以该不同时间段灌装的培养基的培养结果以确定日常灭菌的间隔时长。该方法是对整个无菌制药系统的无菌保证的综合性测试结果。大量事实证明，通过培养基灌装检测出无菌环境出现阳性染菌结果的概率要比隔离器环境监测测试所获得的染菌概率低得多。因此，传统的培养基灌装以确定的灭菌间隔是有风险的。而通过诸如持续的正压维持、在线的粒子监测及日常微生物评估等方法以对无菌环境进行维持，在此基础上确立的灭菌间隔是比较稳妥的做法。
小结
目前，有多种灭菌方法可选择以除去各种物品表面的“生化污染”。过氧化氢蒸汽灭菌技术作为一种新兴灭菌技术，其本身特有的无毒副残留、快速、易于验证、可靠安全等优点越来越被国内外制药界及生物技术领域的普遍青睐。无论是设备供应商，还是终端的使用者，他们面临的的问题不是如何正确理解过氧化氢的灭菌机制和原理，而是如何科学地应用和验证该新兴的灭菌工艺。在当前国内市场日益增高的质量诉求下，规范的灭菌工艺、科学的验证手段成为制药界乃至生物医疗领域的当务之急。不管采用何种过氧化氢灭菌工艺，不能简单地认为达到预定的灭菌目标就判定灭菌工艺验证合格。只有配合使用物理或化学监测手段，通过合理的灭菌周期开发和确定以获得预期所需的物理、化学及微生物结果时，才能判定过氧化氢灭菌工艺的合格。●
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