克伦特罗ELISA试剂盒

一．产品运输及储存条件本试剂盒属生物制品，需在低温（2～4℃）条件下进行运输与储存，注意不可长时间暴露于阳光下或高温环境中，亦不可使其冻结，否则将会造成试剂盒失效。二．产品介绍本产品为于尿液、动物组织、饲料等样品中克伦特罗痕量检测的ELISA快速检测试剂盒。三．装箱单1．试剂盒使用说明书1份2．酶标记物（绿盖）1瓶3．底物缓冲液（白盖）1瓶4．底物液（黑盖）1瓶5．终止液（黄盖）1瓶6．浓缩洗液（透明白盖）1瓶7．0μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶8．0.1μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶9．0.3μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶10．0.9μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶11．2.7μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶12．8.1μg/L克伦特罗标准溶液（红盖）1瓶13．包被偶联抗原的96孔酶标板（12条8孔可拆酶标条）1块14．塑料封口袋1个内装干燥剂1袋四．产品性能指标1．本试剂盒内含所有酶联免疫分析需用的试剂（包括标准样品）2．本试剂盒可检测96份样品（包括标准样品）3．本试剂盒需配酶标仪进行检测4．样品处理         （1）尿液：无需处理       （2）组织：水溶液热提法       （3）饲料：HCL溶液提取法5．标准曲线图1标准曲线IC₅₀在0.5～0.9μg /L（kg）范围内6．检测限          尿液……………………0.1μg/L        组织……………………0.1μg/kg        饲料……………………50μg/kg7．回收率    尿液中：95%±15%        组织中：95%±15%        饲料中：95%±15%8．精密度           批内变异系数＜5%批间变异系数＜10%10．检测耗时  37℃条件下反应约25min，室温反应约30min11．交叉反应Clenbuterol（克伦特罗）………………………………………………… Salbutamol（沙丁胺醇）……………………………………………小于0.01％Mabuterol（马布特罗）……………………………………………小于0.01％Terbutalin（特普他林）……………………………………………小于0.01％Cimaterol（西马特罗）……………………………………………小于0.01％Simarterol（塞曼特罗）……………………………………………小于0.01％Bromobuterol（溴布特罗）…………………………………………小于0.01％Fenoterol（非诺特罗）…………………………………………… 小于0.01％Carbuterol（卡布特罗）…………………………………………… 小于0.01％Ractopamine（莱克多巴胺）………………………………………小于0.01％Adrenalin（）……………………………………………小于0.01％Noradrenalin（去甲）……………………………………小于0.01％Isoproterenol（异丙）……………………………………小于0.01％Enrofloxacin（恩诺沙星）…………………………………………小于0.01％Aureomycin（金霉素）……………………………………………小于0.01％Terramycin（土霉素）………………………………………………小于0.01％Tylosin（泰乐菌素）………………………………………………小于0.01％Taimulin（泰妙菌素）………………………………………………小于0.01％Acheomycin（四环素）……………………………………………小于0.01％Organic chromium（铬）………………………………………小于0.01％五．产品特点

试 剂 盒 先 进 性
特  异	试剂盒采用高质量的克伦特罗单克隆抗体，检测特异性很强，与多种β-兴奋剂、常用兽药及饲料添加剂基本没有交叉反应（＜0.01%），可避免或减少假阳性。
简  便	试剂盒动物组织样品前处理采用热水浴快速提取法，简便快速，无需酸碱处理、无需溶剂萃取、无需过C18柱，成本极低； 试剂盒采用酶标记抗体直接竞争ELISA检测模式，大大减少了检测步骤，与其他同类试剂盒相比至少减少3步操作，检测时间仅约25min（37℃）。
稳  定	试剂盒检测结果与GC-MS确证结果符合率高（克伦特罗检测回收率：尿液中为95%±15%，组织中为95%±15%，饲料中为95%±15%）； 试剂盒批内变异系数＜10%，批间变异系数＜20%； 试剂盒保质期长，达12个月。
灵  敏	试剂盒检测尿液与组织样品的检测限可达到0.1μg/L(kg)。
人性化	试剂盒将加样体积设计为50μL（标准品、样液、酶标记物、终止液）与100μL（底物液与底物缓冲液的等量混合液）两种，改变了国内外同类试剂盒中多种加样体积（反应过程需分别加样20μL、50μL、100μL等）的现象，从而减少操作人员出错的机会。 试剂盒设计有几种反应条件可供用户自由选择，例如：检测全过程可在室温条件下或37℃条件下（节省时间）进行，酶标板洗涤可直接采用蒸馏水洗涤或采用试剂盒配备的洗液（水质条件不稳定的单位可以采用）进行洗涤。

六．原理克伦特罗（clenbuterol），化学名为4-氨基-α-[ (叔丁胺基)甲基]-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐，属于β-兴奋剂（β-Agonist）的一种。由于克伦特罗能显著降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉产量（由此得名“瘦肉精”），曾在畜牧业上作为生长促进剂被广泛使用。克伦特罗有较大的毒性，当人们食用高残留克伦特罗的动物性食品时，会出现心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐、发烧、颤栗、神经过敏、血管扩张、心率加快、肌肉震颤等中毒症状。因此，欧美等国早已禁止克伦特罗在畜牧生产上的应用，我国农业部于1997年3月发布[农牧发(1997)]3号文件，禁止克伦特罗在动物生产中的应用。1999年再次发布文件，禁止其使用，并规定了在动物组织中的限量。然而，由于经济利益的驱使，克伦特罗违法滥用的现象仍然较为普遍，中毒现象屡屡发生。图2 克伦特罗分子结构式因此，加大对克伦特罗残留的检测，成为了监控其滥用与中毒的主要手段。通常，检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法（HPLC），气相色谱－质谱法（GC-MS），毛细管区带电泳法（CE）和免疫分析技术（IA）等等。HPLC法与GC-MS法是克伦特罗残留检测的确证方法，其优点是检测精确度高，但因其仪器化程度高、检测时间长、过程繁琐、检测费用昂贵等而阻碍其推广应用，而酶联免疫分析（ELISA）快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法。本试剂盒为一种直接竞争ELISA试剂盒。在微孔条上预包被偶联抗原；加入样品或标准品，样品或标准品中的克伦特罗与微孔条上预包被的偶联抗原竞争结合酶标记的克伦特罗单克隆抗体，游离的酶标记抗体通过洗涤被除去；再加入显色液，结合的酶标记抗体使无色的显色液转化为蓝色，加入反应终止液后再转变为黄色，在450nm处测量，样品吸光值与样品中克伦特罗含量成负相关，通过标准曲线即可计算出样品中克伦特罗含量。本试剂盒检测原理示意图如下所示：

①未包被酶标板
②将包被抗原包被在酶标板上
③首先将标准品或待检样品加入到包被好的酶标板微空内
④然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体，孵育期间包被抗原与样品中的被检药物将同时竞争酶标抗体，如果样品中的被检药物含量多则与包被抗原结合的酶标抗体就少，反之就多
⑤通过洗涤将反应液中未与包被抗原结合的酶标抗体去除
⑥加入底物缓冲液与底物液的混合液，酶标抗体上辣根过氧化物酶将催化底物进行显色反应（由无色变为蓝色）
⑦达到显色时间后，加入硫酸溶液终止酶促反应，同时反应溶液由蓝色变为金黄色，此反应液可通过酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，从而通过软件计算得到待检药物的浓度

七．检测步骤1．样品处理样品应避光冷藏。1.1尿样一般不需处理，如果尿样浑浊，应进行离心或过滤处理。1.2动物组织样品（样品稀释倍数为2倍）

（1）捣碎：将动物组织样品用组织捣碎器捣碎，或用刀剁碎（浆状）； （2）称取5±0.05g 样品装入15mL离心管中或其他容器，加入5mL蒸馏水，混匀； （3）热提：沸水浴中煮10～15min； （4）澄清处理：在4000g或更大离心力下离心10～15min，或过滤；（5）离心后的上清液或过滤后的澄清滤液作为样品提取液（4℃条件下可保存24h），取50μL进行分析。

将组织样品捣碎 称重 加水后沸水浴热提10min 组织样品明显变色 后取出 离心 吸取上清液用 试剂盒测定

1.3饲料样品（样品稀释倍数为100倍）（1）用研钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的样品，加入2mL1mol/L HCL，加入16mL去离子水均质；
    （2）涡旋混匀5min后，放振荡器上振荡15min；（3）以2000r/min离心20min，转移出上清液并加入2mL1mol/L NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5～7.5之间（若没在此范围应检查溶液是否配错，加以校正）；
    （4）以2000r/min离心20min，转移出上清液（如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）；
    （5）用去离子水10倍稀释上清液（加100μL清液到900μL蒸馏水中，并且混合均匀）；
    （6）取50μL进行分析。2．测定程序（两种反应条件可供选择）2.1室温反应（注意室温20～26℃条件下操作）

（1）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～26℃）下平衡30min以上，将需用的条板固定于支架，按顺序编号； （2）在标准品孔中加入50μL标准品，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL酶标记物（加入标品和样品时无时间差的影响），轻拍混匀，室温（20～26℃）下孵育20min； （3）倒出孔中的液体，以蒸馏水（pH6.0～8.0）作为洗液，或以试剂盒浓缩洗液稀释20倍后作为洗液，用洗板机洗涤4～6遍；没有洗板机的用户可用300μL蒸馏水（或稀释后洗液）充入各孔中，静置20s，倒出孔中的液体，将微孔架倒置，在吸水纸上连续拍打3次以上，以保证完全除去孔中的液体，重复操作4～6遍； （4）将底物缓冲液与底物液等量混合，每孔加入100μL混合液，轻拍混匀，室温（20～26℃）下避光孵育10min； （5）每孔加入50μL反应终止液，混匀后在波长450nm（以空气为空白）测定各孔吸光值（必须在加入终止液后60min内读取吸光值）。

室温（20～26℃） 平衡30min        加入50μL 标准品与样品   加入50μL酶标记物 室温（20~26℃） 孵育20min 蒸馏水或洗液 洗涤4~6次   拍干后，加入 100μL显色液    暗处室温孵育10min后终止 酶标仪450nm测定结果

2.2 37℃条件下反应（1）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～26℃）下平衡30min以上，将需用的条板固定于支架，按顺序编号；（2）在标准品孔中加入50μL标准品，样品孔加入50μL待测样品，然后每孔加入50μL酶标记物（加入标品和样品时无时间差的影响），轻拍混匀，37℃条件下孵育15min；（3）倒出孔中的液体，以蒸馏水（pH6.0～8.0）作为洗液，或以试剂盒浓缩洗液稀释20倍后作为洗液，用洗板机洗涤4～6遍；没有洗板机的用户可用300μL蒸馏水（或稀释后洗液）充入各孔中，静置20s，倒出孔中的液体，将微孔架倒置，在吸水纸上连续拍打3次以上，以保证完全除去孔中的液体，重复操作4～6遍；（4）将底物缓冲液与底物液等量混合，每孔加入100μL混合液，轻拍混匀，37℃条件下避光孵育10min；（5）每孔加入50μL反应终止液，混匀后在波长450nm（以空气为空白）测定各孔吸光值（必须在加入终止液后60min内读取吸光值）。八．结果计算方法（1）样品中未知的克伦特罗含量通过标准曲线计算；（2）将标准品和样品吸光值转换为相对吸光值，即所获得的各标准品和样品吸光度值的平均值（B）除以个标准品（0标准）的吸光值（B₀）再乘以100；（3）以标准品（B/B₀）×100为纵坐标、对应标准品浓度（μg/L）的自然对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度（μg/L）可根据相对吸光值从标准曲线上读出（可采用编好的Excel程序计算结果）。Excel计算软件如图例所示。九．操作注意事项（1）    试剂盒应在2～8℃冰箱内储存，且注意不可冻结。（2）    请勿使用过期的试剂盒或其中的组件。（3）    不要混用不同批次试剂盒的试剂。（4）    将试剂盒内试剂稀释或者改变其浓度将会影响检测结果。（5）    当从冰箱中取出试剂盒进行检测时，应将试剂盒于室温（20～26℃）下放置半小时以上，使其温度回升至室温。（6）    试剂盒内的各种试剂在使用前应充分摇匀（酶标物溶液轻摇即可，不可起泡），以确保试剂浓度的均一性。（7）    微孔条按需使用，将剩余的微孔条立即放入包装袋中，于2～8℃干燥密封的条件下保存。（8）    向酶标板微孔中加入试剂或样品时，为确保操作的一致性，加液时枪头应垂直悬空至板孔正中央，保证样液应加至孔中央，动作迅速，避免枪头接触孔壁，避免样液溅到孔壁或溅出微孔，造成不必要的非特异性吸附或损失。特别是加入共同试剂（如酶标抗体），由于可能会用到排枪，该操作尤为重要。（9）    加样完毕后，应将酶标板至于振荡器或用硬物轻敲，使孔中液体充分混匀，但需注意的是切勿不可将孔中的液体摇出，影响检测结果。（10）样品前处理注意事项：尿样，若样品中出现浑浊或沉淀，可将其至于离心机中适当离心，取其上清液作检测样品;肝样或肉样，请参照说明书提供的方法进行提取。于水浴锅中提取时，水浴应始终保持沸腾，若由于其他原因达不到所需温度（但不得低于85℃），可适当延长提取时间，直至组织样品明显变色为止（由红色变黄褐色或白色），且趁热进行离心，离心力保持在4000g/r以上以保证上清液澄清。（11）如果选择室温条件下反应，在整个检测过程中，应保持温度在20～26℃之间，同时为了避免反应过程外界环境因素的影响，酶标板上应贴上一层薄膜或置于封闭环境中避光反应；如果选择37℃条件下反应，建议在水浴锅中进行，且酶标板上也应贴上一层薄膜，防止试剂的挥发。（12）洗板时如果选择蒸馏水作为洗液，要保证洗涤用水的pH范围在6～8之间；如果水质较差请选择试剂盒配备的浓缩洗液稀释后作为洗液。为了确保洗涤的一致性，建议洗涤时采用专门配置的洗板机，反复洗涤4～6次，每次洗涤的体积以溢满微孔为宜（约300μL）。如用其他方法洗板时，请注意操作方法，避免清洗不彻底或产生交叉污染。（13）在加入酶底物液进行显色时，可向板孔中先加50μL的底物缓冲液，然后再加入50μL的底物液（注意加完后混匀液体），或者将底物缓冲液和底物液充分混匀后（混匀容器应洁净，现配现用），再向每孔中加入100μL的混合液。（14）终止液含有1mol/L硫酸溶液，避免皮肤直接接触，操作时要注意安全。（15）采用酶标仪读数时，为了确保结果的准确性，读数前仪器应先开机预热15min以上，再读数。（16）推荐使用高质量的吸头及移液器，且吸头不可反复使用（难以清洗干净）。

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