【名称】通 用 名：肉毒杆菌E/F型(BL-E/F)核酸检测试剂盒
英 文 名：Botulinus E and F Type Double Fluorescence
Polymerase Chain Reaction (PCR)Diagnostic kit
【目的】本试剂盒适用于检测肉毒杆菌E型或者F型DNA，用于肉毒杆菌E或者F型感染的辅助诊断。其检测结果仅供临床参考。【原理】本试剂盒用一对肉毒杆菌E型和一对肉毒杆菌F型特异性引物，结合特异性探针，用双色荧光PCR技术对肉毒杆菌E型或者F型核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。【组成】
| 名称 | 数量 | 规格 |
| 核酸提取液 | 2 管 | 1.5ml/管 |
| Taq 酶系 | 1 管 | 50μl/管 |
| BL-E/F-qPCR MIX | 1管 | 1.0ml/管 |
| BL-E/F-阳性质控品 | 1 管 | 50μl/管 |
| 阴性质控品 | 1 管 | 250μl/管 |
【储存条件】-20℃避光保存，避免反复冻融。【试剂规格及有效期】48 T/盒，有效期6个月。说明：不同批号的试剂组分不可交互使用。【适用仪器】取得资格认证的荧光定量PCR仪。【标本采集】1. 用无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入无菌EDTA
2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。2. 取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血便送检。【保存和运输】标本建议立即送检，如果需要保存建议于-20℃或者-80度保存，不超过6个月。避免反复冻融。标本运送时应采用0℃冰壶。【使用方法】1. 接种培养上述标本建议经过增菌后，收集培养物用于检测。2. DNA提取培养物：上述培养物50ul或者挑取的单克隆菌落加入50μl核酸提取液(使用前请室温溶解并充分混匀) 并与沉淀混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清4μl进行PCR反应。 血液标本：直接取200ul抗凝血，转至一洁净的1.5ml 离心管中，加入1ml 双蒸水，剧烈震荡30s，8000rpm离心5min，弃上清，至无明显红色沉淀。(若沉淀明显，请再重复上述步骤一次)。加入1ml生理盐水，剧烈震荡15s，13000rpm离心5min，弃上清。沉淀加入50μl核酸提取液(使用前请室温溶解并充分混匀) 并与沉淀混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清4μl进行PCR反应。粪便标本：取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5ml生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入50μl核酸提取液(使用前请室温溶解并充分混匀) 并与沉淀混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清4μl进行PCR反应。其他液体标本：取标本2-3ml，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀加入50μl核酸提取液(使用前请室温溶解并充分混匀) 并与沉淀混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清4μl进行PCR反应。上述标本也可以选用取得资格认证的商业化试剂盒提取DNA。3．PCR扩增从试剂盒中取出BL-E/F qPCR MIX、Taq酶系、逆转录酶系室温融化并振荡混匀后，瞬时离心。设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | BL-E/F qPCR MIX | Taq酶系 |
| 用量 | 20μl | 1μl |
计算好各试剂的使用量，在一个灭菌洁净离心管中充分混匀，瞬时离心，向设定的N个PCR反应管或反应板中加入21μl上述试剂，然后再分别加入4μl 提取的待测样品、BL-E/F阳性质控品和BL-E/F阴性质控品，瞬时离心。放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阳性质控品、阴性质控品以及待测样品，并设置样品名称、报告基团设置为FAM和HEX（或JOE或VIC），其中FAM基团检测BL-E，HEX（或JOE或VIC）基团检测BL- F，淬灭基团为TAMRA)。推荐扩增条件为：94℃→2分钟，后94℃ 30秒→55℃ 45秒（采集荧光），40个循环。基线调整取6-15个循环的荧光背景信号，阈值设定原则上以阈值线刚超过阴性质控品的检测荧光曲线的点。4. 结果分析判定反应结束后，针对FAM和HEX（或JOE或VIC）双通道，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct 值均在40以上，Ct 值小于35的为阳性；Ct 值在35-40之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在35-40之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。其中FAM通道为BL-E检测结果，HEX（或JOE或VIC）通道为BL- F检测结果。5. 质控标准阴性质控品：CT值均显示UNDET或者CT=40，即结果为阴性；阳性质控品：Ct 值均应小于 30，且呈标准“S”型扩增曲线。以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。【注意事项】1. 使用前请仔细阅读说明书。并且严格按照说明书进行操作。2. 试剂盒内各种组分使用前应充分融化混匀并经高速短暂离心后试用。3. 所有使用的离心管、 Tip 头应用DEPC水处理并高压灭菌，而且必须不含 RNase 。4. 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。5. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。【生产企业】 公司名称：广州维伯鑫生物科技有限公司公司地址：广州科学城科珠路232号 邮政编码：510663 电话：020-38635161传真：020-38207232生产地址：广州科学城科珠路232号公司网址：Http://www.vipoion.com电子邮箱：info@vipoion.com
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