本试剂盒采用间接竞争ELISA法检测尿样和组织等样本中的克伦特罗，在微孔条上预包被偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行，样本中的克伦特罗和微孔条上预包被偶联抗原竞争标记有辣根过氧化酶的抗克伦特罗抗体，通过洗涤后，用TMB底物显色，样品中的克伦特罗含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出克伦特罗含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.1ppb
检测时间： 45min
样本检测下限：
尿 样 ………………………………… 0.1ppb
组 织（处理法一）…………………… 0.4ppb
组 织（处理法二）…………………… 0.1ppb
饲 料 …… …………………………… 1 ppb
交叉反应率：
克伦特罗（Clenbuterol）…………………
特普他林（Terbutalin）…………………… <0.1%
马布特罗(Mabuterol) ……………………… <0.1%
溴布特罗(Brombuterol) …………………… <0.1%
沙丁胺醇（Salbutamol ）………………… <0.1%
莱克多巴胺（Ractopamine）……………… <0.1%
样本回收率：
尿 样 ……………………… 95%±10%
组 织 ……………………… 85%±15%
饲 料 ……………………… 85%±15%
【试剂盒组成】
1、 微量测试孔：1×96孔板（12条×8孔）
2、 （Clenbuterol标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3、 酶标记抗体工作液 10ml………………绿色帽
4、 底物A液 7ml ……………………白色帽
5、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
6、 终 止 液 7ml ……………………黄色帽
7、 20X浓缩洗涤液40 ml ………………透明帽
【 所用仪器、试剂】
具备的仪器：微孔酶标仪、氮气吹干装置、打印机、均质器 、振荡器、离心机、恒温箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管
微量移液器：单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道250µl
试 剂：氢氧化钠、乙酸乙酯、浓HCl、乙腈、甲醇、正己烷、无水硫酸钠
【样本前处理步骤】
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1、0.1M HCl 溶液
取0.86ml浓HCl加水定溶至100ml。
配液2、0.1M NaOH 溶液
称取0.4g NaOH加水定溶至100ml。
配液3、乙腈-0.1M HCl 溶液
V乙腈：VHCl =84：16
（a）尿样本的处理方法
取20µl清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或离心10min，4000r/min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。
样本稀释倍数：1
（b）组织样本的处理方法一
1、 称2±0.05g组织，加入6ml去离子水，充分振荡2min，室温4000r/min以上离心10min(注：若组织样本中油脂含量较高，可在振荡后放入85℃水浴10min后再离心)。
2、 取20µl上清液进行分析。
样本稀释倍数：4
（c）组织样本的处理方法二
1、 称取 2 ± 0.05g 的组织， 加入6ml乙腈-0.1MHCl，振荡2min,室温4000r/min以上离心10min。
2、 取上清3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，振荡1min，室温4000r/min 以上离心10min。取全部上清于50℃氮气或空气吹干。
3、 加入1ml三蒸水复溶，混合30s，取20µl进行分析。
样本稀释倍数：1
（d）饲料样品的处理方法
1. 称1.0±0.05g研碎的饲料样品，加入10ml甲醇，再加入5g无水硫酸钠，放振荡器上振荡2min；15℃ 4000r/min以上离心10min；
2. 吸出离心后的上清液1ml，于56℃氮气吹干，用1 ml 去离子水溶解干燥的残留物，再加入1mL正己烷混合30s ；15℃ 4000r/min以上离心5min。
3. 取20µl下层进行分析。
样本稀释倍数：10
【酶标免疫分析程序】
1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 加标准品/样本20µl/孔到各自的微孔中，然后加入80µl/孔的酶标记抗体工作液，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min 。
6、 取出微孔板，甩出孔内液体，用配制好的洗涤液按250μl /孔洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，用吸水纸拍干.
7、 显色：每孔先加入底物液A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
8、 测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定吸光度值（OD值）。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含克伦特罗的含量成负相关。
1、粗略判定：
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含克伦特罗浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.892；0.1ppb为1.501；0.3ppb为1.175； 0.9ppb为0.751；2.7ppb为0.421； 8.1ppb为0.198。则样品1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb；样品2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。
1、定量分析：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ B ×
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以克伦特罗标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克伦特罗实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
3、标准曲线：
B/B0 (%)
0.1 0.3 0.9 2.7 8.1
克伦特罗(ppb) [µg/kg]
图1：克伦特罗检测试剂盒的回归曲线
4、再现性：
%CV 
克伦特罗(ppb) [µg/kg]
图2：克伦特罗检测试剂盒的精密度
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出克伦特罗检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应克伦特罗浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
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