一、概要
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、严基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前检测孔雀石绿的方法有两种：HPLC或GC-MS，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。本试剂盒采用竞争酶标免疫法，可经济、快速地检测水样中的孔雀石绿、结晶紫等残留。
本试剂盒是应用ELISA技术研发而成的检测产品，能限度地减少操作误差和工作强度。
二、试验原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被孔雀石绿抗原，样品残留的孔雀石绿和微孔条上预包被的抗原共同竞争抗孔雀石绿抗体，加入酶标二抗后，经TMB底物显色，样品吸光度值与其残留物孔雀石绿呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中孔雀石绿的含量。
三、适用范围
可定性、定量检测鱼池或者鱼缸水样中的孔雀石绿残留。
四、交叉反应率
显性孔雀石绿 ……………………………………………
结晶紫 ……………………………………………………180%
五、提供的材料与试剂
酶标板
孔雀石绿显性高浓度标准品81ppm*
孔雀石绿酶标物
孔雀石绿抗试剂
底物液A液
底物液B液
终止液
浓缩洗涤液（10×）
孔雀石绿浓缩样品稀释液（5×） *注：孔雀石绿显性高浓度标准品用于标准曲线的配制及水样的添加回收。
六、检测步骤
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20～25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2～8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。
5 加标准品/样品：加标准品/样品50μl/孔到对应的微孔中，然后加入抗试剂50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤4～5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。
7、加酶标物：加入酶标物100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。
8、显色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min。
9、测定：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。（若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定）。
七、方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.1ppb
样品检测限：
水样………………………………………………………0.2ppb
回收率：
水样……………………………………………………100±10%
精密度：试剂盒的变异系数均小于10%
八、注意事项
1、整个样品处理过程要迅速，不应放置过长，以防影响检测结果。
2、室温低于20℃或试剂及样品没有回到室温（20～25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
3、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
4、每加一种试剂前需将其摇匀。
5、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
6、不要使用过了有效日期的试剂盒；不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
7、储存条件:保存试剂盒于2～8℃，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
8、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。
9、浓缩洗涤液内部如有结晶属正常现象，请加热溶解后使用。
10、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15～20min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到30min。反之，则减短反应时间。
11、该试剂盒反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、贮藏条件及保存期
贮藏条件：保存试剂盒于2～8℃。
保存期：该产品有效期为12个月。
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