近日，中国农科院植保所抗病虫作物生态安全评价与利用创新团队在植物生物学领域的国际著名期刊《植物细胞》（The Plant Cell）上在线发表了题为“Efficient in situ epitope tagging of rice genes by nuclease-mediated prime editing”的研究论文，该研究借用基于CRISPR/Cas核酸酶的引导编辑系统，通过微同源介导末端连接途径实现了水稻多个内源基因的高效精准标记，为水稻内源基因标签研究提供了全新的编辑策略。
标签蛋白便利于科学家研究蛋白质的互作关系、信号通路和分子机制，被广泛应用于生命科学领域的分子生物学、细胞生物学和生物化学研究中。相对于传统转基因技术介导的外源标签蛋白研究，其过量表达有时会造成研究结果的不可靠性，通过基因编辑技术直接标签内源靶基因创制材料，研究结果更能反映靶基因在细胞内参与的生理生化过程和实际功能。长期以来，如何突破高效的植物内源基因标签技术一直都是生物技术研究人员关注的重要课题。
在该研究中，研究人员首先借助多种优化策略在水稻上建立了高效的引导编辑系统，测试靶位点的编辑效率高达95.83%。进一步探索了基于CRISPR/Cas核酸酶的引导编辑系统，通过不同DNA修复途径（非同源介导的末端连接/NHEJ和微同源介导的末端连接/MMEJ）在水稻内源基因精准标记中的潜力。
结果表明两种策略均能实现水稻内源基因的精准FLAG标记，但MMEJ介导的 NM-PE策略在精准性和效率上比NHEJ介导的 NN-PE策略更优。此外，借助的SpRY和ScCas9核酸酶，松弛型的引导编辑器通过NM-PE策略成功实现内源基因OsMPK3、OsMPK6、OsMPK7、OsMPK10、OsMPK11的精准标记，编辑效率高达70.83%，大大扩展了NM-PE标签策略在水稻基因组中的应用范围。最后，研究人员探索了NM-PE在水稻内源双基因标签中的潜力，结果表明后代基因编辑群体拥有大量单、双基因精准标签植株以及基因敲除植株。综上，基于CRISPR/Cas核酸酶介导的双链DNA切割和微同源介导的末端连接途径的NM-PE策略，可以实现水稻靶基因的多核苷酸精准操作、精准标签及敲除等，在未来水稻蛋白标记组学研究、基因功能研究和遗传改良方面具有很大的潜力，也为其它农作物和经济作物相关研究提供的全新的思路。
中国农业科学院植物保护研究所博士研究生李雪琪（海南专项）和博士研究生张素杰为本文共同第一作者，周焕斌研究员为通讯作者，团队多名成员共同合作完成，北京农林科学院李少芳研究员、挪威生物经济研究所Carl Spetz研究员、青岛农业大学黄金光教授、中国农科院植保所周雪平教授也参与了相关研究工作。该研究得到了农业生物育种重大专项、国家重点研发计划、中国农业科学院南繁专项基金、海南省种业重点实验室和中国农业科学院创新工程等项目的支持。
论文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae316
日期：2024-12-17
