中国农大新闻网讯 近日，植物保护学院周涛团队在《科学进展》（Science Advances）杂志上发表了题为“Maize splicing-mediated mRNA surveillance impeded by sugarcane mosaic virus-coded pathogenic protein NIa-Pro”的研究论文，揭示了玉米剪接因子ZmU2AF65B调控mRNA监测通路及其被病毒蛋白阻遏的机制。该研究围绕玉米矮花叶病发生的分子机理，以主要病原物甘蔗花叶病毒（SCMV）编码的致病蛋白——核内含体蛋白酶NIa-Pro作为“探测器”，揭示了玉米中剪接因子ZmU2AF65B对mRNA监测通路的调控机制，并发现NIa-Pro通过抑制ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模块的功能进而削弱了mRNA监测通路，从而有利于病毒侵染。
转录后加工是真核生物基因表达过程中的一个关键步骤。在这一阶段，转录本容易受到细胞内外多种因素的影响，导致RNA发生异常修饰、剪接错误或断裂等问题。为避免有害多肽的产生，真核细胞依赖mRNA监测通路来识别和降解错误加工的mRNA。因此，该通路在调控基因表达中起重要作用。先前的研究已经基本揭示了mRNA监测通路的工作机理，但对其调控机制的理解还很有限。
mRNA监测通路是一个依赖于核糖体翻译起始的mRNA质控过程，其下游主要包括三个分支：无义介导的mRNA衰变（NMD）、停滞介导的mRNA衰变（NGD）和非终止介导的mRNA衰变（NSD）。具体来说，当核糖体在第一轮翻译过程中遇到提前终止密码子（PTC）或因特定RNA结构而停滞时，会分别激活NMD或NGD。许多病毒产生的RNA中也含有PTC和/或特定的RNA基序，使得它们容易成为NMD和/或NGD的靶标。因此，由mRNA监测通路介导的病毒RNA降解被认为是一种广谱的抗病毒机制。此外，异常剪接的转录本中通常包含PTC或具有长的3'UTR、uORF或特定的RNA结构，这些特征使得它们被mRNA监测通路识别和清除。但有意思的是，在一些剪接体功能异常的突变体植物中，mRNA监测通路的靶标转录本会出现明显累积，暗示了剪接因子可能在调控mRNA监测通路中发挥作用。同时，病原物侵染使得寄主细胞中剪接体功能异常后，也能观察到大量具有PTC等特征的可变剪接转录本的累积。在此种背景下，进一步使用病原物效应子来探究pre-mRNA剪接过程是否以及如何调控mRNA监测通路将十分有意义。
前期，该团队发现SCMV侵染引起的可变剪接转录本的变化具有促进病毒侵染的作用（Du et al., Plant Physiology, 2020, 184: 1514-1531）。为进一步理解SCMV调控可变剪接的机制，该研究中利用TurboID邻近标记结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法，筛选了多个与NIa-Pro潜在互作的剪接因子；进一步通过可变剪接报告系统、互作验证及内源剪接因子表达沉默实验，证实了SCMV编码的NIa-Pro通过与ZmU2AF65B的互作，进而操纵RNA剪接。
随后，利用Iso-Seq技术，该研究发现Zmu2af65b功能缺失突变体（d2）中mRNA监测通路基因的可变剪接发生紊乱，且靶标转录本累积明显，初步揭示了ZmU2AF65B通过可变剪接正调控mRNA监测通路。通过与SCMV侵染的玉米中发生可变剪接变化的转录本进行联合分析发现，在SCMV侵染的玉米或d2突变体中，mRNA监测途径的6个主要基因（包括ZmUPF3）的转录本有类似的可变剪接变化。已有研究表明UPF3通过作用于外显子连接复合物（EJC）在mRNA监测通路的起始阶段发挥重要作用，并在后续的NMD分支中作为核心组分；拟南芥中的NMD途径通过靶向AtUPF3产生的具有长3'-UTR的转录本来调节AtUPF3的mRNA水平，从而保证mRNA监测通路的功能不会过强或者太弱（负反馈循环）。有意思的是，我们发现在WT玉米中，ZmUPF3通过“内含子保留”而产生具有长3'-UTR的转录本；但在d2植株中不仅产生更少类型的ZmUPF3可变剪接转录本，而且不产生具有长3'-UTR的转录本，从而破坏了ZmUPF3的负反馈循环。鉴于上述这些重要发现，该研究之后聚焦到了ZmUPF3。通过RNA-EMSA和MST等实验证实了ZmU2AF65B可以直接结合ZmUPF3的pre-mRNA，且主要与3‘剪接位点附近的尿嘧啶富集串进行结合，而且对尿嘧啶富集程度更高的内含子的结合能力更强，进而保证ZmUPF3转录本的正常可变剪接模式，实现对mRNA监测通路的正调控。
同时，该研究通过在ZmUPF3表达沉默植株和Zmu2af65b功能缺失突变体中进行侵染性实验，以及基因功能回补实验，证实了ZmU2AF65B-ZmUPF3是一个抗病毒分子模块。此外，通过互作实验、剪接报告系统、突变体病毒侵染以及回补实验，证实了SCMV编码的NIa-Pro通过结合ZmU2AF65B的RRM结构域，破坏了ZmU2AF65B的RNA剪接调控功能，从而抑制了由ZmU2AF65B-ZmUPF3分子模块以及mRNA监测通路介导抗病毒作用，最终有利于病毒侵染。
中国农业大学植保学院博士后杜开通（入选我校首批兴农青年学者）为第一作者，周涛教授为通讯作者，植物病毒研究室成员博士生彭得智、王培、姜彤博士、陈曦博士和范在丰教授，荷兰格罗宁根大学吴季秋博士，华大基因朱亚兵博士和姜三杰博士，山东农业大学李向东教授，河北农业大学曹志艳教授为本研究的完成做出了重要贡献。在本文研究和撰写过程中得到了清华大学刘玉乐教授、南京农业大学董莎萌教授、上海师范大学乔永利教授、中国农科院植保所李方方研究员、中国农业大学王书伟博士、张永亮教授和郭海龙教授的大力帮助和宝贵建议；该研究得到了国家自然科学基金、中国博士后科学基金会和北京市科学基金等基金的资助。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn3010
日期：2024-11-11
