柑橘作为芸香科植物，种类繁多，生产上涉及三属八大类，是中国也是世界第一大水果，产业规模位居世界前列。然而随着人们对柑橘品质的要求逐渐多元化，如何培育更多优质的柑橘品种是目前育种工作者的难题。芽变选种是一种常用的育种方法，芽变是指在芽的分生组织细胞中遗传物质自然发生的突变，是体细胞发生的变异，目前果树芽变选种主要利用这一突变进行新品种选育，在细胞分裂复制并萌发抽生出枝条后，通过嫁接进行遗传，这是一种高效且低成本的育种方式，但同时也存在随机性。芽变通常改变品种的单个性状，如果实颜色、果实形状、果实无核、熟期等，因此通过芽变可以对本身具有优良性状的品种进行针对性改良。为了推动更多的柑橘芽变选种工作，本文对近10年柑橘芽变选种历史进行回顾和展望。
近10年选育出的柑橘芽变新品种
发生芽变会导致植株多种性状的改变，不同类型的芽变在不同物种中改变的性状也不相同。芽变的表现复杂多样，主要包括：叶的形态变异，如柑橘中的宽叶与窄叶之间发生的变异；果实的形态变异，如毛桃变异成油桃；枝条的形态变异，如柑橘枝条中有刺突变为无刺；植株的形态变异，如苹果短枝芽变便是一种特别突出的变异。芽变现象在很多果树中都会发生，发生频率较高的果树有苹果、柑橘、桃、枣、葡萄、梨等，比率最高的为柑橘和苹果，芽变频率分别是75.4%和36.2%。近10年国内选育出的柑橘芽变新品种如表1所示。
甜橙类
柑橘属中的脐橙通常由芽变选育而成，针对熟期方面，国内外从芽变选种中培育出了大批优良的早熟及晚熟品种，改善了脐橙熟期过于集中的问题。华盛顿脐橙由普通甜橙芽变而来，纽荷尔脐橙又由华盛顿脐橙芽变选育而来，是世界著名良种之一，树势好、风味佳，但其果形不匀、差异较大，因此以纽荷尔脐橙为母本进行芽变选种，培育出整齐统一的果形是工作重点。
夏橙是柑橘属的一个重要晚熟品种，但存在果实偏小、产量偏低的不足，广西特色作物研究院通过芽变选种培育出果大少核的优良品种桂夏橙1号。冰糖橙具有化渣、低酸、果肉脆嫩等优点，周嘉发现，冰糖橙红肉芽变株系具有较高的开发潜力。周小娟对晚棱脐橙及其芽变材料“南瓜状脐橙”的相关生物学性状进行分析发现，“南瓜状脐橙”晚熟、皮薄汁多、维生素C含量高、风味浓郁，对这一芽变材料的挖掘和选育，具有良好的市场推广前景与应用价值。同时，也从普通冰糖橙中选育出抗寒晚熟品种晚香蜜橙和抗逆性好、综合性状优良的黔阳冰糖脐橙。
柑类
在温州蜜柑方面，已从最原始的初代品系“在来系”和“伊木力”中先后选育出了早生和尾张等177个芽变品种，形成了丰富的温州蜜柑品种群。例如，由尾张温州蜜橘进一步芽变中选育出来的丰产稳产新品种华夷1号，由温州蜜柑龟井25的抗寒芽变选育出的优质抗寒柑橘新品种龟井2501，由大分早生温州蜜柑中发现的特早熟芽变新品种橘湘早。贡柑为中国宽皮柑橘主栽品种之一，但其种子较多、风味寡淡、不耐贮藏，科研人员通过芽变的方法选育出了很多无核或少核柑橘品种。
橘类
南丰蜜橘有风味佳、皮薄肉嫩、芳香宜人的优点，但同时也存在不化渣的缺点，作为芽变选种材料，具有较大的发展潜力。如柳城蜜橘、阿香2号和粤丰早橘便是从南丰蜜橘芽变中选育出的综合性状优良、化渣性好的新品种。蜜广橘是南丰蜜橘的自然杂交种，从蜜广橘中芽变选育出桂橘一号优良芽变株系。从春甜橘自然芽变单株中选育出来的柑橘品种明柳甜橘，果实品质优良。砂糖橘品质佳，但多籽，采用芽变选种技术也选育出早熟品种金葵蜜橘以及粤农晚橘、华晚无籽砂糖橘和春红糖橘等晚熟品种。
椪柑在我国广泛种植，但缺少综合性状优良的品种，因此通过芽变育种选育出丰产稳产、无核性状稳定、品质优良的新品种是椪柑产业中的重要需求。华中农业大学培育出的华柑4号无核椪柑品种为我国椪柑产业提供了品种支撑。通过对金水柑母本树及后代进行观察而选育出少核椪柑新品种金水椪柑2号，其果实品质优良、风味浓郁、耐贮藏。
柚类
琯溪蜜柚作为一种优良蜜柚品种，也培育出六月早、红绵蜜柚和黄金蜜柚、三红蜜柚、迷你红柚等芽变优新品种。最原始的葡萄柚为白皮白肉的邓肯，由它实生变异出无核马叙，其果肉和果皮仍保持白色，可以通过芽变选种培育出更多优良品种。
柑橘芽变新进展
芽变的机理
芽变的细胞学机理
当梢端分生组织中的细胞发生变异时，才有可能发生芽变。现有对分生组织的研究主要有顶端细胞学说、组织原学说、组织发生层学说、分区学说和原套原体学说等。早在1940年Satina等就提出了组织发生层学说，其仍是目前解释芽变的主流学说。
梢端位于茎的顶端，是指新梢的起始生长部位，梢端的分生组织中有3个独立的细胞层，叫做组织发生层。这3个细胞层分别使用LⅠ、LⅡ、LⅢ进行表示，各起源层以不同的方式进行细胞分裂，之后形成不同的组织。表2是苹果梢端分生层的衍生情况，LⅠ层位于最外侧，通常只有一层细胞，进行垂周分裂之后分化为器官的表皮；LⅡ层位于中间层，通常也含有一层细胞，可进行平周分裂和垂周分裂，之后分化为外皮层和大部分内层细胞；LⅢ层位于最内侧，与前两层不同的是可含有多层细胞，且既有垂周分裂，也有平周和斜向分裂，通常会分化成器官的维管组织。一般而言由于植物种类和器官的不同，分化成的组织也存在差异。
当这3层组织发生层中的个别细胞发生突变，之后突变的细胞与未突变细胞同时进行细胞分裂，进而分化出拥有不同性状的变异组织，则称之为嵌合体。由于发生突变的细胞具有随机性，在任何一层都有可能发生，因此嵌合体可分为周缘嵌合体和扇形嵌合体，细胞嵌合体主要类型如图1所示。周缘嵌合体一般发生在大多数细胞还未开始分裂时，发生的时间较早；扇形嵌合体一般发生在细胞已经开始大量分裂时期，发生的时间较晚。随着时间的推移，变异在经过人工或自然的选择之后得以纯化和稳定，表现出明显的变异性状，几乎所有最初是嵌合体的不定尖芽，都会变成非嵌合体或周缘嵌合体，并被人们发现和利用。
在柑橘果实中，LⅠ层产生果实的汁胞和外果皮，LⅡ层产生种子、囊衣、皮下组织和中果皮，LⅢ层产生维管束，比如Zhang等研究了由常山胡柚（O）嫁接到尾张温州蜜柑（C）上形成的OCC（LⅠ-LⅡ-LⅢ＝O-C-C）嵌合体，分析了OCC和两个亲本之间果实中原代代谢物、挥发性物质和类胡萝卜素等各成分的含量，确定嵌合体的果皮来自尾张，而汁胞来自常山胡柚。在这些组织发生层上发生变异时，可以通过生殖细胞遗传给后代，所以育种者往往会应用这些材料来分离、纯化变异，使有利的性状由嵌合状态成为同质体，从而进行稳定遗传。
芽变的分子机理
柑橘主要进行无性繁殖，在遗传上高度杂合，因此人们对其芽变分子机理的研究相对局限。目前，多集中于反转录转座子插入、表观遗传（以DNA甲基化的研究为主）、基因结构变异、染色体变异等方面。
转座子又称转座元件，可以通过转移或复制从基因组中某一位点进入到另一位点，从而导致遗传物质发生改变。按照转座方式，转座子可以分为两大类，一类在转座酶作用下直接以DNA进行转座，称为DNA转座子；另一类则通过反转录酶将RNA反转录成DNA之后进行转座，称为反转录转座子，在高等植物基因组中以高拷贝的形式普遍存在。正是由于不同品种在形成转座子时条件和机制的不同，以及同一转座子在不同品种中的拷贝数差异，人们开发了一些基于转座子来鉴别芽变的技术。比如，柯玲俊等便利用转座子显示技术（TD），筛选了5个DNA转座子和4个反转录转座子，有效地鉴别了不同成熟期、有核无核、色泽突变等多种性状的柑橘芽变品种；吴志娟等则基于反转录转座子插入多态性（RBIP）分子标记，筛选出17个位点，构成了45份越橘品种和1份蔓越橘品种的唯一分子身份证，为越橘品种的鉴别提供了有力工具。
表观遗传是指在生物体内的DNA序列未发生变化的情况下，其表型却发生了可遗传的变化，其中最早被发现、研究最深入的表观遗传调控机制之一便是DNA甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化作用下，在基因组DNA链上的胞嘧啶（C）第5号碳原子上共价结合一个由S-腺苷甲硫氨酸作为供体的甲基基团，最终形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），该修饰方式能够改变基因的表达，但通过一般的分子标记无法进行检测。在植物中，甲基化通常发生在对称的CG、CHG序列以及不对称的CHH序列中。徐记迪通过研究暗柳橙和红暗柳橙果实不同发育时期的DNA甲基化水平发现，甜橙的DNA甲基化水平介于拟南芥和番茄之间，且在果实不同发育时期的DNA甲基化水平是动态变化的。贾慧慧在研究DNA甲基化对柑橘生殖发育作用时发现，不论是无融合生殖细胞还是孢子体细胞，在植物受精后会发生明显的加甲基化现象。
染色体变异主要包括染色体结构和数目的变异。染色体结构的变异往往造成DNA碱基序列发生变化，是内因和外因共同作用的结果，变异类型包括易位、倒位、缺失、重复等；染色体数目的变异既包括染色体组成倍的增加或减少，同时还包括个别染色体的增加或减少，其中最为常见的便是多倍性变异，一般表现为叶片、气孔、果实等的增大。基因结构变异也是导致芽变的重要原因之一。如由瓯柑突变成的滞绿果实青瓯柑中叶绿素降解关键基因PaO、PPH等和叶绿素循环的关键基因NYC1在转色期显著下调表达，而CAO及调控叶绿体发育的转录因子ELIP和GLK1在转色期及贮藏期显著上调表达，这可能与青瓯柑芽变形成有关。
影响芽变的因素
根据植物遗传物质等的不同，植物发生芽变的部位和频率都会有所差异，例如，芽变通常发生在植物的分生组织中而不是成熟的组织中，这是因为转座子在植物不同的发育阶段其活性有差异。有的植物会因为转座子的存在而有较高的体细胞突变率，而有的植物则因为存在DNA的修复而发生突变的频率较低。除了这些植物自身的差异导致突变概率的不同之外，外界的一些因素也能加快诱导植物体内遗传物质发生改变。
植物在遭受外界环境胁迫时，往往可以增加突变发生的概率，其中大致可分为物理因素和化学因素，物理因素包括温度、水分等逆境胁迫，化学因素包括电离辐射、重金属、紫外线等。前人研究发现，温度的升高会促进拟南芥的突变，盐胁迫和紫外线诱导导致拟南芥体细胞突变水平下降，镉作为一种抑制DNA修复的诱变剂，可大大增加拟南芥的突变水平。
芽变鉴定方法
检测柑橘芽变的方法多种多样，有些可以通过形态学观察来鉴定。但是有的芽变品种则是改变了果实的风味等不好辨别的性状，一般需要细胞学观察和分子标记技术等来确定其遗传物质发生的改变。
细胞学标记主要包括染色体核型和带型。最常用的标记技术便是流式细胞术。流式细胞术是指利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术，通过测量每个细胞中DNA的含量以及DNA含量的变化来检查染色体，从而识别非整倍体和多倍体。然而此技术无法检测到染色体结构和基因结构上发生的变异，且染色体数目变化较难维持遗传稳定性，因此使用有限。如今被广泛应用的鉴定手段为分子标记技术，分子标记多是以DNA序列之间的差异为研究对象，通过构建DNA指纹图谱，分析DNA片段来区分个体间的遗传变异，该鉴定技术可靠且有效，可有效排除环境引发的饰变。所有分子标记可根据检测方法和通量不同分为三大类：第1代是基于分子杂交技术的低通量分子标记，如RFLP；第2代是基于PCR技术的中等通量标记，如RAPD、AFLP、SSR等；第3代是高通量序列标记，如SNP。各分子标记之间的比较及在柑橘中的应用如表3所示。
芽变选种对柑橘产业的推动作用
经过近20年的高速发展，我国柑橘产业在生产规模、品种结构以及产品质量方面都发生了巨大的变化。
芽变选种加快了柑橘产业的大规模、高质量发展。果树新品种产生的重要来源之一就是芽变。就我国柑橘产业的生产规模来说，栽培面积从1961年的7.14万hm2增长到了2021年的293.53万hm2，约增长了40倍，总产量从1961年的18万t增长到了2021年的5595万t，约增长了310倍。我国柑橘栽种面积和产量的快速增长离不开芽变选种。芽变选种得到的新品种与其母树相比，适应性更强，品质也更加优良，在生产中很容易进行大面积的推广应用。另外，芽变选种的操作相对简单，只需要“一把尺，一杆秤，用牙咬，用眼瞪”，便于大规模、群众性的选育工作展开，且一经选出，能即刻进行无性繁殖，快速投入生产，具有成本低、见效快等优点，大大加快了我国柑橘产业的大规模发展。
芽变选种丰富了柑橘品种结构类型，满足了我国市场需求，引领我国柑橘产业高质量发展。柑橘产生芽变的频率在果树中相对较高，据调查，在桃、杏、苹果、梨、柑橘、葡萄6个果树种类总共3674个品种中，芽变的品种占600个，占据了总品种数的16.3%，其中苹果和柑橘发生芽变的概率最高，柑橘芽变的品种占柑橘总品种数的75.4%。脐橙最早是1820年从巴西甜橙中选育出来的无核品种，美国加州于1873年引入脐橙成功后，将其命名为华盛顿脐橙，我国后续引进的一系列脐橙基本直接或间接来自华盛顿脐橙。风味浓、品质优的温州蜜柑也是从某种有核宽皮柑橘的芽变中选育出来的，且随着芽变选种工作的大范围展开，温州蜜柑品种群不断壮大。人们的生活水平不断提升后，已经不局限于风味或外观品质的提高，开始针对柑橘熟期过于集中的问题，广泛展开了柑橘成熟期芽变选种的工作，先后选育出具有早熟特性的赣南早、大分早生和青秋脐橙等，具有晚熟特性的不知火、清见和晚白柚等，显著延长了柑橘的市场供应周期，使柑橘的鲜食品质与市场竞争力都极大地提高，是保障我国鲜食柑橘消费市场周年供应最经济有效的技术途径。
芽变选种得到的优系中的某些特殊物质能够助力产业振兴，促进健康中国的发展。芽变选种选出的温州蜜柑中含有丰富的β-隐黄素，能够有效抵抗癌细胞产生。葡萄柚较其母树含有更加丰富的维生素C和维生素P，能够有效缓解咽喉炎症，减少呼吸道疾病，更是少有的富含钾而钠含量很少的水果，能有效辅助治疗高血压、心脏病和肾脏病。在琯溪蜜柚本身不含番茄红素的情况下，其芽变选育出的红肉蜜柚却含有极其丰富的番茄红素，而番茄红素是目前在自然界植物中发现的最强的抗氧化剂之一，能有效增强人体的免疫力。
展望
芽变选种的未来应当以市场和生产为导向，选育出既能满足消费者口味和需求，又能解决生产中遇到的难题的新品种。例如为解决柑橘集中上市的问题，选育出特早熟或特晚熟的新品种，实现柑橘的全年供应，同时避免集中上市、果贱伤农。选育出一批抗寒、抗病、具有加工品质的品种。长江中下游地区的柑橘产业的扩大始终被寒害这个因素所困扰，因此选育出具有抗寒效应的品种与砧木具有重要的现实意义。对于全国柑橘产业来说，柑橘黄龙病、柑橘裂皮病、柑橘青枯病、柑橘溃疡病等病害长期以来始终对柑橘产业造成危害，加强对抗病或者对这些病害有免疫力的品种或砧木的选育同样也具有现实意义。
由于柑橘育种周期长，加强对柑橘芽变机理的研究有利于人工创造芽变，缩短育种时间，甚至定向诱变所需要的性状。目前大多数的柑橘芽变属于自然变异，随机性大，频率较低，且不可操纵、不可预知。针对性的辐射诱变、化学诱变等人工诱导方式可提高芽变频率，同时芽变和亲本本身就是一份很好的对照材料，通过两者相对比可以发掘控制该变异性状的基因相关功能，为后期进一步研究提供材料。
开发能够高效诱导芽变的现代人工诱导技术是未来芽变育种发展的基础，高效芽变鉴定和筛选手段是关键。近年来现代高通量仪器的发展与分子标记技术的结合产生了可用于诱变群体的基因型和表型的连续多代高通量鉴定，同时高通量靶向测序与DNA标记技术的结合，也大大地提高了DNA变异鉴定的效率。
尽管如今分子育种技术层出不穷，但芽变选种由于操作简单、投入生产较快等特点，在未来的柑橘育种中仍然发挥着重要的作用。我们要加快对柑橘育种机理的研究，抓住我国独特的种质资源，将理论与实践相结合，培育出更多优质新品种，促进我国柑橘产业向前发展。
声明：本文摘编自《中国果树》2024年第5期“近10年柑橘芽变选种新进展”（宋晓婵，程瀚远，赵珍梅，何溢，黄梦寒，陈美玲，李明明，伊华林）。
日期：2024-07-26
