白粉病是葫芦科作物的三大主要病害之一。设施栽培中的高温高湿环境很容易诱导白粉病的爆发，严重影响黄瓜产量和品质。目前，黄瓜白粉病的防治主要依赖化学药剂，然而在一个生长季内需多次施药，对以鲜食为主的黄瓜而言，因农药残留导致的食品安全隐患不容小觑。黄瓜白粉病抗性是由多基因位点控制的数量性状，传统育种技术很难高效整合多个抗病基因而不引入连锁累赘。利用CRISPR/Cas多基因编辑技术同时敲除多个隐性抗病基因创制黄瓜白粉病抗性种质，是黄瓜白粉病防治的新策略，具有重要的经济意义。
近日，华中农业大学别之龙教授/杨丽副教授团队在Plant Physiology在线发表了题为“Systemicanalysis of cucumber MLO family by multiplex gene editing for engineeringpowdery mildew resistance”的研究论文。在瓜类作物中首次建立高效的多基因编辑体系，利用该体系靶向敲除黄瓜CsMLO基因家族13个成员，成功获得白粉病完全抗性黄瓜种质材料，并通过多组学联合分析解析了钙信号参与Csmlo1/8/11介导的黄瓜白粉病抗性分子机制。
黄瓜白粉病抗性基因的研究最早可追溯到1940年代（He et al., 2013）。根据多年来研究人员对不同遗传群体的黄瓜白粉病抗性基因定位研究，翁益群课题组总结归纳了19个共识性QTL位点（Wang etal., 2020）。然而，其中仅有pm5.3位点成功克隆到抗性基因，突显了黄瓜白粉病抗性遗传机制的复杂性。该基因Mildewresistance Locus o 8（CsMLO8）由蔡润和白玉玲课题同时报道（Berget al., 2015; Nie et al., 2015），在抗性材料中由于转座子插入等原因，CsMLO8功能失活导致了隐性白粉病抗性。然而，进一步研究发现，尽管Csmlo8功能缺失突变在许多黄瓜抗性种质中普遍存在，但也观察到部分种质具有Csmlo8突变却表现为白粉病易感的现象。这表明还存在其他抗病位点与Csmlo8共同介导白粉病抗性，黄瓜白粉病抗性的遗传基础仍然有待深入挖掘。CsMLO基因家族成员之间存在功能冗余性，前人的正向遗传学研究结果也发现多个白粉病抗病QTL位点中存在CsMLO家族的其他基因，暗示了其他CsMLO成员与CsMLO8基因共同调控黄瓜白粉病抗性的可能性。因此，对CsMLO基因家族进行系统功能分析将为黄瓜抗病分子育种提供理论基础。
该研究首先采用II型启动子cestrum yellowleaf curling virus （CmYLCV） 驱动由tRNAGly 间隔串联的多个sgRNA，建立了一个高效的黄瓜多基因编辑系统。利用该系统，以易感白粉病的华南型黄瓜CU2种质为受体，对CsMLO基因家族13个成员进行了多基因编辑，获得了一系列Csmlo单、多突变体。进一步，对这些突变体的白粉病抗性和生长表型进行了系统调查。研究发现敲除CsMLO家族第V分支三个基因CsMLO1/8/11，所得单突变体Csmlo8仍然易感白粉病，所得双突变体表现为中等白粉病抗性，尤其值得关注的是同时编辑这三个基因的黄瓜三突变体材料Csmlo1/8/11获得了白粉病完全抗性。然而，并未观察到五突变体Csmlo3/4/5/9/10白粉病抗性的改变。此外，对多个Csmlo突变体生长表型进行系统观察还发现，相较于对照为五瓣花和三心室果实，Csmlo3/10突变体中黄瓜六瓣花、七瓣花的数目显著增多，其四心室果实的比例也大幅提高。这是首次在植物中报道CsMLO家族Ⅱ分支成员的功能。而Csmlo12/13突变则导致雄性不育且叶面积增大的表型。因此，通过对CsMLO家族基因进行多基因编辑，成功获得了白粉病完全抗性黄瓜材料；对家族突变体白粉病抗性和生长发育表型的系统调查，为利用Csmlo进行黄瓜白粉病抗性育种提供了重要的理论依据。
研究人员进一步基于所得不同抗病程度Csmlo突变体，采用高通量转录组与蛋白组关联分析，发现钙信号在Csmlo1/8/11介导的白粉病抗性中发挥着重要的调控作用。在Csmlo1/8/11突变体中，钙信号下游的三个基因CsKIC、CsCML28和CsCPK11的蛋白表达量显著升高。进一步研究发现，CsKIC与第V分支成员CsMLO1/8/11均存在蛋白互作。通过VIGS瞬时沉默CsKIC，能增强黄瓜白粉病抗病性，这表明与CsMLO8的功能一致，CsKIC是白粉病抗性的负调控因子，猜测CsKIC与CsMLO1/8/11互作协同参与白粉病菌入侵过程。另外，通过VIGS瞬时沉默CsCML28和CsCPK11，观察到黄瓜白粉病感病性增加；且二者分别与CsMLO1/8共沉默时，部分恢复了由于CsMLO1/8敲低而导致的白粉病抗性。这表明CsCML28和CsCPK11可能在CsMLO1/8的下游发挥正向调控作用，参与介导黄瓜白粉病抗性。最后，通过稳定遗传转化得到了CsCPK11过表达植株，与对照相比，其白粉病抗性显著增强。这些发现为深入理解Csmlo介导的黄瓜白粉病抗性机制提供了关键线索。
综上所述，该研究为瓜类作物生物育种提供了高效的多基因编辑工具，为黄瓜白粉病抗性育种提供了宝贵的基因和种质资源。该研究深入解析钙信号参与Csmlo1/8/11介导的白粉病抗性分子机制，也为丰富白粉病抗病调控模型提供了新的理论依据。
华中农业大学园艺林学学院别之龙教授和杨丽副教授为本文共同通讯作者，在读博士生马明茹和杨丽副教授为第一作者。西北农林科技大学李大伟副教授和华中农业大学孔秋生教授参与了本项研究。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、湖北省自然科学基金创新群体和湖北省重点研发项目等课题资助。
日期：2024-02-26
