近期，江南大学生物工程学院陈献忠教授团队在熊蜂生假丝酵基因编辑技术方面取得重要进展，研究成果“A CRISPR–Cas9 system mediated genetic disruption and multi-fragment assembly inStarmerella bombicola”正式发表于ACS Synthetic Biology（IF=5.11, 2022） （DOI: 10.1021/acssynbio.1c00582）。
槐糖脂作为一种生物表面活性剂，因其具有乳化性、增溶性、抑菌性及生物可降解表面活性等特性，近年来展现出相当广阔的市场应用前景。熊蜂生假丝酵母（Starmerella bombicola）作为槐糖脂生产菌株之一，可以在以油酸和葡萄糖为共同碳源的条件下生产槐糖脂。然而，该菌株作为一种非常规假丝酵母，其遗传背景并不清晰，且表达系统不够完善，同时常规的基因改造手段效率低。因此在很大程度上限制了该菌株的代谢工程改造。
陈献忠教授团队针对上述问题，以酵母增强型绿色荧光蛋白（yEGFP）为报告基因，筛选熊蜂生假丝酵母启动子表达元件，获得了系列转录强度不同的启动子。在此基础上，将来源于酿脓杆菌的Cas9基因进行密码子优化，在强启动子PTEF1驱动下构建了整合表达型CRISPR-Cas9编辑系统。通过设计并结合不同强度启动子及sgRNA表达元件对该系统进行优化，最终在大大提高阳性转化子数量的同时，使得单基因及双基因编辑效率达到100%，并实现了三基因的同时编辑（16.5%）。该团队也对瞬时表达系统进行了评价，发现瞬时表达的CRISPR-Cas9系统在单基因编辑时也可以达到100%的编辑效率。此外，在CRSIPR-Cas9系统的介导下，通过体内一步多片段组装技术，在敲除内酯化酶SBLE和过氧化物酶体膜转运蛋白PXA1基因的基础上，进一步利用强组成型启动子PTEF1及PENO，上调槐糖脂合成关键基因CYP52M1及CPR的表达，最终得到了单一生产酸型槐糖脂高产重组菌株，其酸型槐糖脂的产量可以达到99.5 g/L，相比于野生型菌株提高了5.5倍。本研究为该菌株在代谢工程改造方面提供了高效的编辑工具，同时也为槐糖脂的进一步应用奠定了基础。
陈献忠教授为上述系列论文的通讯作者，我校2021级博士生石依博为第一作者。上述研究得到了国防科技项目（18-163-12-ZT-003-014）和江苏省自然科学基金（BK20171138）等项目资助
近年来陈献忠教授团队以具有重要工业应用潜力的非常规酵母为底盘细胞，开发了系列高效的基因编辑技术和代谢调控方法（Biotechnology and Bioengineering, 2020；Microbiology Spectrum，2022），并通过系统代谢工程构建了高效生产萜类天然产物的酵母细胞工厂（Biotechnology for Biofuels and Bioproducts, 2022）。
日期：2022-06-07
