近日江南大学生物工程学院周哲敏教授团队在基因编辑研究方面取得突破，成功构建了适用于蛋白质体内原位进化的碱基编辑器。研究成果“Development of a base editor for protein evolution via in situ mutation in vivo”发表于《Nucleic Acids Research》杂志（JCR一区，影响因子：16.971）（https://doi.org/10.1093/nar/gkab673）。
蛋白质定向进化在生命科学领域举足轻重。传统的蛋白质定向进化通过体外突变与高通量筛选相结合的手段获得优势突变体。然而，受限于外源重组表达技术以及体外功能检测技术瓶颈，传统研究手段难以对膜蛋白、蛋白复合体及毒性蛋白等进行体外进化。
为了解决这一问题，周哲敏教授研究团队独辟蹊径，开发了基于CRISPR-Cas系统介导的碱基编辑器实现蛋白质体内原位进化的新方法。该研究以枯草芽孢杆菌为底盘细胞，首先将来源于Petromyzon marinus的胞嘧啶脱氨酶（PmCDA）和nCas9蛋白以新的方式融合后整合到底盘基因组，构建出一种整合型高效碱基编辑器（CRISPR-CDA-nCas9-UGI）。该编辑器能够在一个较宽的编辑窗口（15-20 nt）内发生高效C→T转换，编辑效率接近100%；编辑窗口宽度及编辑效率能够通过诱导剂浓度、持续迭代等手段实现调节，且可靶向多个基因以及单个基因的多个位点，这些特点保证了突变的高效性和突变体的多样性。该编辑器适用于构建蛋白质原位突变体文库，并从中筛选出合适的突变体。基于该系统研究者分别对膜蛋白复合体Sec转运酶和bacitracin抗性蛋白（BceB）展开体内原位定向进化，成功获得了分泌效率提升3.6倍的突变株以及对bacitracin产生不同敏感度的突变株。经过新一代高通量测序，发现该系统的脱靶率很低，表明系统具有极高的特异性。
本研究将基于CRISPR的碱基编辑系统和蛋白质定向进化相联系，在CRISPR-Cas已有的基因插入、删除及参与基因表达调控等功能之外，成功拓展出了新的应用领域。研究不仅为复杂蛋白质和蛋白复合体的功能进化提供了新的技术，也为构建含有进化蛋白质的底盘细胞提供了新的研究思路。
周哲敏教授为该论文的通讯作者，江南大学19级博士生郝文亮和我院崔文璟副教授为该论文的共同第一作者。上述研究工作得到了国际科技合作创新重点项目（2017YFE0129600）、国家自然科学基金（21878125）、江苏省自然科学基金（BK20181206）等项目的资助。
日期：2021-08-17
