葡萄（Vitis vinifera L.）是世界四大水果之一，具有很高的经济价值。我国葡萄种植面积为79.79万hm2，居世界第二，产量高达1349万t，居世界首位（联合国粮农组织2018年数据）。在全球葡萄产业高速发展的同时，葡萄病害问题日益严重，其中葡萄枝干病害被认为是过去30年来最具破坏性的葡萄病害，危害严重。据统计，全球葡萄种植区每年更换因枝干病害导致的坏死葡萄树消耗超过15亿美元，美国加州葡萄年产值约为230亿美元，但因枝干病害造成的损失超过2.6亿美元。由于目前没有高效稳定的杀菌剂、抗病品种缺乏、农业防治成本过高，葡萄枝干病害亟需开发新的防治手段。
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葡萄枝干病害的发生特点
葡萄枝干病害是一类真菌性病害，主要包括葡萄衰枯病（ESCA）、葡萄溃疡病（Botryosphaeria Dieback）、葡萄顶枯病（Eutypa dieback）、葡萄蔓枯病（Diaporthe dieback）和葡萄黑根病（Black Foot Disease）等5类，其病原十分复杂，主要包括Botryosphaeriaceae、Phaeomoniellaceae、Togniniaceae、Diaporthaceae等9个科中32个属（如Botryosphaeria、Phaeoacremonium、Eutypa、Diatrype）的真菌，如葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）中已知引起葡萄溃疡病的真菌包括Botryosphaeria、Diplpdia、Neofusicoccum、Lasiodiplodia等9个属35个物种，并且在不同的地域、气候环境中导致同一类枝干病害发生的病原菌会有所差异。在自然条件下，病原菌主要通过植物的气孔、伤口等侵入葡萄，定殖在多年生的木质化枝干中，在适合条件下导致维管束病变，在枝干中央部分产生褐色条纹或者由溃烂导致枝干变色、坏死，多数情况下还会引起叶片的黄化、坏死和变形等，最终导致葡萄在短期或长期内死亡。
葡萄枝干病害最重要的发生特点是机会性发病，即病原菌以内生性的方式在健康树体中长期潜伏，当遇到极端环境或树体健康不良的情况，其生活方式可由内生性转变为致病性，从而导致枝干、叶部和果实发病，并且存在第N年发病、N+1年不发病、N+2年是否发病不可预测的情况，这种机会性发病特点与其所处的环境以及树体的健康状态息息相关。
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单一生防菌株防治葡萄枝干病害的效果
植物的各个器官组织及其赖以生存的根系土壤中定殖着多种微生物，它们与植物之间存在多种作用方式，从共生到致病，这种相互作用对植物生产力、健康和微生态等起着关键的作用。其中益生菌可通过竞争生态位、抗生作用、诱导抗性等抑制病原菌的生长繁殖或直接杀灭病原菌，也可附着在植物表面形成防御层，提高植物免疫力，从而产生防病促生作用。
由于葡萄枝干病害具有受环境及自身免疫力影响较大的机会性发病的“慢性病”特征，因此科研人员通过筛选并外源添加益生菌，调节植物微生态，以提高植物自身免疫力或直接抑制病原菌，以期实现对葡萄枝干病害的防治。截至目前，已有50余种不同来源的微生物菌株对葡萄枝干病害的生物防治效果被研究，如木霉菌（Trichoderma）、粉红螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）、假单胞菌MP12（Pseudomonas sp. MP12）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其中木霉菌（Trichoderma）的使用频率最高，也只有木霉属（Trichoderma spp.）的菌株被开发成产品，如哈茨木霉（T. harzianum）T39、AG1，但其发挥功能的前提是成功并长期定殖在葡萄枝干内，具体防效受到施用方法、葡萄品种、气候条件以及枝干病害的种类等因素的限制。Patricia等发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PTA-271可增强葡萄的免疫反应，并使参与植物解毒过程的酶PAL（苯丙氨酸解氨酶）、STS（芪合酶）及GST1（编码谷胱甘肽S-转移酶）显著表达，增强解毒作用，有效防治溃疡病，但其防效具有温度依赖性，仅在28℃左右有效，在实际生产中很难控制；Yacoub等发现生防菌寡雄腐霉（Pythium oligandrum）的接种能使多个涉及葡萄防御的基因的表达水平显著增加或降低，强烈地刺激葡萄的防御反应，加强对衰枯病病原菌Phaeomoniella chlamydospora的攻击，当接种在扦插苗根部时可减少坏死40%~50%，但必须保证生防菌能成功接种并定殖在扦插苗上，其防效受其定殖情况的影响。
由此可见，使用单一生防菌株来防治葡萄枝干病害的防效不稳定，且进行菌株的纯培养、筛选和制剂等过程所消耗的成本较高，不是最高效的防控手段。
03
微生物组与葡萄枝干病害发生的相关性
微生物组是指包括微生物和其基因组以及其周围环境在内的全部。近年来，微生物组研究已经取得巨大进展，并在一些领域取得了显著的效益，特别是在作物微生物组领域，科研人员利用微生物组-植物-植物病害的相互作用关系，在了解微生物组的结构与功能的基础上，挖掘和建立核心益生微生物组或功能菌群，从微生态角度来防治植物病害，提高作物产量。
在自然条件下，植物的抗病能力与植物微生物组的组成和功能息息相关。研究表明，有益微生物组有多种抗菌防病的作用机制：产生抗菌物质或通过重寄生、生态位竞争，尤其是通过调整真菌-细菌间的平衡等作用直接抑制病原菌的增殖；通过诱导寄主抗性或微生物生防菌活性间接抑制病原菌的致病性；改变植物的生理状态等以刺激植物的免疫系统，间接提高其对病原体的抵抗力，使免疫系统更有效地对抗致病菌；转化环境中所存在的营养物质，提高植物生长所需要的营养水平，并促进其对营养物质的吸收，产生直接促生作用。核心微生物组是指在自然条件下对植物发挥特异性抗逆作用的微生物集合，即可稳定、高效遗传且维持自然微生物群体功能的最小子集。因此，相较于单纯依赖培养和筛选生防菌，基于微生物群落结构分析及微生物培养构建核心微生物组则可以获得更多的益生菌资源。前者由于生防菌株单一而导致防控效果不稳定；后者所构建的核心微生物组则能够在促进植物生长、增产和抗病等方面发挥更加持久高效的作用，并已在多种植物中得以应用。冀宇等利用3种功能菌株淡紫拟青霉（Purpureocillium lilacinum）YES-2、红灰链霉菌（Streptomyces rubrogriseus）HDZ-9-47和植物根际促生菌苍白杆菌（Ochrobactrum spp.）NC1人工构建并研制出一种防控黄瓜根结线虫的功能型复合微生物菌剂，该菌剂高效、增产且环境适应性强，在田间对移栽后38d和105d病株防效达56.5%和42.5%，并使黄瓜增产10.7%，株产量达2.375kg；诺维信旗下公司通过对植物根系微生物组的规模化分析将成功分离、培养出的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和绿木霉菌（T. virens）进行配比和成分优化，研制出田间增产效果优良且稳定的种子包衣剂，可使小麦每公顷增产220~250kg。
目前，葡萄微生物组的研究已经取得了一些进展。植物和微生物可相互影响，研究表明，多种因素可以影响葡萄微生物组，包括砧木基因型、大气等，而葡萄微生物组可能与其病害的发生息息相关。
Deyett等利用微生物组分析挖掘出患皮尔斯病（Pierce's disease）的葡萄藤汁液的核心微生物群，包括链球菌（Streptococcus）、拟杆菌（Bacteroides）等7类细菌以及枝孢属（Cladosporium）、球腔菌属（Mycosphaerella）等5类真菌，它们在整个物候期均存在，并在患中度皮尔斯病的葡萄中富集，且中度皮尔斯症状的葡萄比健康或严重症状的葡萄显示出更高的微生物多样性，这表明葡萄可以通过调动和调节微生物组来抵抗病原体的攻击或参与某种关键的生理反应，以增强抗病力和适应能力，达到抗病的目的。同时研究者还从中确定了几种与抗病、促生相关的细菌和真菌靶标，如假单胞菌属（Pseudomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）等。Asghari等发现与使用单一内生细菌防治葡萄冠瘿病相比，同时使用假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Sn48和泛菌（Pantoea sp.）Sa14可使植物抗毒素和病程相关蛋白防御基因的表达显著增加并产生诱导抗性，大量研究也表明拮抗内生细菌群［包括枯草芽孢杆菌（B. Subtilis）EN631、芽孢杆菌（Bacillus sp.）EN71-1等］对冠瘿病的防控更加高效、稳定。
此外，研究表明微生物组可能与葡萄枝干病害的发生相关。Nerva等利用微生物组分析比较了有、无葡萄衰枯病（Esca）症状的葡萄根围土壤微生物群落组成，发现其细菌和真菌群落相对丰度没有显著差异，但衰枯病病原体和其他枝干病病原体在有病害症状土壤中更为丰富，如Neofusicoccum和Phaeoacremonium是最丰富的真菌属，且Phaeoacremonium和Phaeomoniella属在有病害症状的土壤中富集，此外，芽孢杆菌属（Bacillus）和链霉菌（Streptomyces）分别在有、无病害症状土壤中富集，推测它们可能是潜在的抗病菌种。Del Frari等对发生衰枯病的葡萄枝干不同位置进行ITS区域扩增测序和群落结构分析，结果显示，在有、无“虎纹斑”叶片的枝干中真菌群落结构没有明显差异，前者中白腐病原菌嗜蓝孢孔菌（Fomitiporia sp.）是优势种群，而在后者中与衰枯病相关真菌P. chlamydospora是优势种群，这些结果表明葡萄枝干真菌群落不受其叶片“虎纹斑”症状影响，反之亦然，由枝干病害病原菌引起的维管束病变可能是导致其“虎纹斑”叶片的原因。Niem等基于同一葡萄园中有、无枝干病害症状（溃疡）树体枝干内生真菌、细菌群落结构分析，发现相较于有症状树体，Pseudomonas spp.在无症状树体中的相对含量为56%~74%，显著高于有症状树体（2%~29%）。对分离培养所得到的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）与已知GTDs病原菌（葡萄溃疡病菌、葡萄顶枯病菌和葡萄衰枯病菌）进行对峙培养试验，获得了10株具有拮抗活性的菌株，说明这些菌株具有作为生防菌用于防治GTDs的潜力。
此外，对葡萄整个树体的微生物组研究表明，葡萄地下部分的微生物群落多样性比地上部分更加丰富，它们可通过根组织向地上部分运输，其中土壤是主要源库，同时，葡萄根际富集的链霉菌（Streptomyces spp.）、假单胞菌（Pseudomonas spp.）和根瘤菌（Rhizobia）是参与其磷和氮代谢最活跃的细菌。这表明地下部分的益生菌群具有达到地上部分发挥抗病功效的潜力，葡萄地下部分微生物组对葡萄的生长与健康至关重要。这些结果表明土壤可作为生防菌的“储存库”，建立抑菌菌群，这有可能成为一种潜在的有效抑制枝干病害替代方案。
因此，通过微生物组学分析界定、分离葡萄的核心益生微生物组可为防治葡萄病害提供新的理论基础和菌种资源。虽然目前通过微生物组学来获得核心益生微生物组，以成功防治葡萄枝干病害的研究还未见报道，但利用微生物组学来防治枝干病害是非常有希望的途径。
04
葡萄枝干病害相关微生物组学
研究方法局限及改进
通过微生物组学研究方法明确与葡萄枝干病害发生相关的微生物群落结构和功能特征是实现其应用的前提。微生物群落的基本结构和特征是该群落中微生物的物种分类与丰度、基因功能特征及不同微生物间的相互作用。目前描述微生物群落的物种丰度主要有2类方法，即相对定量和绝对定量，毫无疑问，绝对定量对微生物群落的描述更加准确，但因其操作繁琐，对植物内生菌的引物特异性差，目前对微生物群落研究主要使用相对定量法。
相对定量法是指提取样品总DNA后，利用二代或者三代测序技术对基因扩增子、宏基因组或宏转录组样本进行测序，序列经过物种注释后，依据每个物种的序列多少来进行物种丰度的描述，单个样本中物种丰度是指不同物种OTU序列占全部序列的比例，但当比较2个及以上样本的物种结构差异时，由于不同样本的微生物总量是不同的，这种相对丰度比较可能造成失真的现象，掩盖了样本的真实群落结构。
目前微生物组的绝对定量方法主要有2种。一种是向样本中添加内参以确定样本微生物总量。首先选择合适的DNA片段作为内参基因的主要序列，选择的原则是内参序列与扩增目标序列的长度及GC含量相似，该序列可以由随机DNA片段生成器生成（https://www.faculty.ucr.edu），并于其序列两端连接测序所用引物，如16S rRNA、18S rRNA及ITS等基因序列片段扩增所用的引物。由于土壤对裸露DNA片段以及细菌本身的吸附性不一致，所以一般将该片段连接在载体并克隆到大肠杆菌的感受态细胞中后，再添加到样品中，而不是直接将裸露的DNA片段添加到样品中。最后按照比例定量添加到土壤样品中，混合样本按照常规样品进行DNA提取、片段扩增及测序，根据测序结果中内参的序列相对丰度及实际添加量来对其他物种进行定量。第2种方法：利用qPCR技术通过高通量测序的引物对样本中的微生物（细菌或真菌）绝对总量进行定量，然后再根据测序数据得到的相对含量确定不同分类水平物种的绝对含量。以上2种方法仅适用于土壤等环境样本，当检测植物内生样本时，由于植物中质体的DNA中具有保守的16S rDNA及ITS序列，测序结果中难以区分数据来源于微生物或植物本身。针对这一问题，Guo等开发了宿主相关绝对定量分析方法（Host-associated quantitative abundance profiling, HA-QAP），该方法将植物特异基因（如水稻开花调节基因RID1）作为内参的主要序列，在两端连接16S rRNA及ITS通用引物，形成内参DNA片段，并将之按比例添加到植物和环境混合样本DNA中，在扩增PCR片段前，利用qPCR对内参及样本中的RID1基因拷贝数进行定量，之后利用高通量测序确定内参及整个样本的reads数，最终确定定量丰度（quantitative abundance, QA），即微生物标记基因（如16S rRNA、18S rRNA基因及ITS）相对于植物基因组的比值。此外，由于人们常用16S rRNA基因来对细菌进行定量，但是细菌中16S rRNA基因存在一到多个拷贝现象，因此其结果也会造成偏差，因此，Wang等利用单细菌单拷贝持家基因rpoB来校准16S rRNA基因，对样本微生物群进行绝对定量，其结果更加准确。
由此可见，绝对定量法通过比较2个样本中的含量来确定优势物种要比相对定量法比较相对丰度更加准确，尤其是葡萄枝干病害机会性发病，长期潜伏会造成病原菌量的变化和积累，病原菌可能因突破一定的量才开始显症，所以绝对定量对解释枝干病害的发生机理以及确定核心微生物种至关重要。
此外，测序时扩增子测序是利用特异性引物扩增16S rRNA、18S rRNA及ITS的特定区域，也可根据研究目的不同，扩增特定的功能基因来研究某一类微生物群体，例如扩增nifH基因来研究可以进行固氮作用的微生物群体。宏基因组及宏转录组则是对整个样本所有物种的基因组及转录组进行测序，其关注的不单是某一个基因，能够解释葡萄枝干病害中发挥致病或抗病功能的主要物种以及相关的基因和作用通路等功能信息，但仅是理论上的预测结果，必须要与培养组学相结合，通过分离、培养鉴定出菌株并接种，才能进一步验证所得信息结果，并将其用于后续研究。
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小结与展望
葡萄枝干病害机会性发病的特点致使其发病时间难以确定，防治困难，相较于单一的生防菌的筛选与应用，利用微生物组来防治是很有潜力的方法。葡萄与枝干病害的微生物组研究受到国内外越来越多的关注，但目前研究较少，虽已有报道说明葡萄微生物组与其枝干病害发生有关，但仍需对葡萄枝干病害相关的微生物组进行大量研究，特别是绝对定量微生物组法等方法的引入，可以更准确真实地阐明与葡萄枝干病害相关的微生物群落结构，为将来的核心微生物组构建及其精准移植奠定基础。
声 明：本文摘编自《中国果树》2021年第5期“微生物组学在葡萄枝干病害防治中的研究进展”（郭令紫，李兴红，张玮，彭军波，刘梅，周悦妍，李永华，燕继晔）。
日期：2021-06-22
