背景介绍
花生是常见的食品过敏原之一，具有发病率高、过敏反应严重和对过敏个体产生终身持续影响等特点。研究表明，发酵可降低花生的致敏性，还可提高花生的口感、消化率和营养价值；此外发酵菌及其代谢产物可调节Th1/Th2反应的平衡，增强上皮屏障功能，有助于减缓过敏水平甚至预防过敏。
纳豆芽孢杆菌是一种安全、耐酸、耐热的益生菌，具有抗菌、抗癌、溶栓等多种功能活性。纳豆芽孢杆菌还具有很强的产酶能力，可以有效降解蛋白质。高压灭菌常用于微生物发酵和降低花生致敏性。本研究利用纳豆芽孢杆菌联合高压灭菌辅助发酵工艺降低了生花生浆的致敏性，使用ELISA检测了发酵对花生过敏原的影响并研究了发酵过程中花生蛋白结构的变化，以期为花生蛋白的结构特征和致敏性提供新的信息，为开发低过敏花生发酵产品奠定基础。
研究方法
将脱红衣花生与水以1:9（m/v）的比例混合、磨浆后制成花生浆（RPP），将RPP在121 ℃下高压灭菌20 min获得灭菌花生浆（APP），后接种9.8×105 CFU/mL的纳豆芽孢杆菌并在37 ℃下培养，以不同时间（12、24、36、48、60 h）发酵后收集样品，并标记为FAPP-B-12、FAPP-B-24、FAPP-B-36、FAPP-B-48、FAPP-B-60。提取各组蛋白，并以牛血清蛋白为标准品，采用Bradford法测定蛋白质浓度。使用SDS-PAGE测定各组蛋白的分子量，通过间接ELISA确定IgE结合能力。使用扫描电镜观察花生蛋白的微观结构，结合圆二色谱评估蛋白质二级结构的变化并利用紫外光谱仪测定不同样品的紫外吸收光谱，通过ANS法确定每个样品的表面疏水性，并用SH-DNTB测定游离巯基的含量，最后使用高灵敏度纳米颗粒分析仪测定花生蛋白粒径。
结果与分析
结果表明，高压灭菌和发酵会导致高分子量的花生蛋白逐渐降解（图1）。间接ELISA的结果表明在单独高压灭菌后，RPP的过敏原性降低了66.6%，随着发酵进一步降低（图2）。使用扫描电镜观察花生蛋白的微观结构，发现FAPP-Bs具有更小的聚集体和更松散的网络结构（图3），这可能是由于纳豆芽孢杆菌在发酵过程中产生的蛋白酶催化花生蛋白去折叠和降解所致。圆二色谱（图4）和紫外吸收光谱（图5）的结果表明，高压灭菌和发酵诱导了花生蛋白的水解、去折叠和构象变化以及α-螺旋的减少，这些变化均会显著影响表位的形成。蛋白质疏水性的改变通常反映其三级和四级结构改变，使用ANS荧光探针和SH-DNTB分别测定了不同处理后花生蛋白表面疏水性和游离巯基的变化，结果表明当发酵48小时后，花生蛋白三级结构受到的影响最大；高温灭菌会引起蛋白质聚集，可能导致游离巯基在分子内部或分子间形成二硫键，发酵过程中游离巯基含量的进一步降低可能与生成的蛋白或过氧化物导致游离巯基隐藏或氧化有关。粒径分析表明，由于高压灭菌引起的蛋白质聚集，APP的粒径大部分分布在550 nm至100 nm之间。
图1 从RPP、APP和FAPP-Bs中提取的蛋白质的相对分子量
（M，标准蛋白质的分子量；1-7依次代表从RPP，APP，FAPP-B-12，FAPP-B-24，FAPP-B-36，FAPP-B-48，FAPP-B-60提取的蛋白质）
图2 RPP、APP和FAPP-Bs蛋白的致敏性
图3 冻干产物外观（第一排）及蛋白质扫描电镜（第二排和第三排放大倍数分别为200和4000），1-7依次代表RPP、APP、FAPP-B-12、FAPP-B-24、FAPP-B-36、FAPP-B-48、FAPP-B-60的冻干产物及其蛋白质
图4 （A）RPP，APP，FAPP-Bs的圆二色谱；（B）根据其比例计算出相应的二级结构
图5 从RPP、APP和FAPP-Bs中提取的蛋白质的三级结构。A，紫外吸收光谱；B，荧光发射光谱；C，游离巯基（SH）含量
结论
结果表明，高压灭菌和纳豆芽孢杆菌发酵可降解花生蛋白、改变蛋白质构象并减少α-螺旋，引起花生蛋白质粒径的变化，从而导致生花生IgE结合特性显著降低。因此利用纳豆芽孢杆菌联合高压灭菌辅助发酵是生产低致敏性、高品质花生制品的有效工艺手段。
日期：2021-03-24
