12月16日，北京市农林科学院玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室基因组编辑团队在Frontiers系列新期刊Frontiers in Genome Editing上发表题为“Genome engineering in plant using an efficient CRISPR-xCas9 toolset with an expanded PAM compatibility”的研究论文。该研究建立了基于SpCas9变体xCas9的基因敲除系统和胞嘧啶碱基编辑系统，成功将基因编辑的前间区序列邻近基序（PAM）范围拓展至GAD（D=A,T,G）和松弛型的NG，为在更广泛的基因组范围内选择基因编辑靶点提供了可能。
拓展CRISPR/Cas9核酸酶PAM范围是使其在植物中被更广泛应用的关键。2018年，David Liu团队在Nature上报道了一种能识别NG，GAA和GATPAM的SpCas9变体（xCas9）。2019年，多个实验室相继报道了xCas9在植物上的表现，发现其能够拓展基因组编辑范围至NGPAM位点，但对于GAA和GAT PAM 位点，在水稻T0苗中仅有一个GATPAM位点实现编辑被报道。而目前具有更大PAM范围的另一SpCas9变体（SpCas9-NG）在植物中和动物中都不识别GAA和GATPAM。因此，为了将基因组编辑范围拓展至GAA和GATPAM位点，植物中的xCas9基因编辑系统亟待优化和提高。
本研究通过使用tRNA连接强化sgRNA，形成高效的tRNA-esgRNA系统，开发出了基于xCas9的基因编辑系统 （CRISPR-xCas9），首次发现CRISPR-xCas9在植物中能够有效的切割GAAPAM位点和多个GATPAM位点，同时发现其还能够有效切割多个GAGPAM位点（动物中尚无报道），并且仍然保持编辑松弛型的NGPAM位点的能力。该研究进一步利用相似的载体结构开发了基于xCas9的胞嘧啶碱基编辑系统 （xCas9n-CBE），发现xCas9n-CBE在植物中可以对基因组上的以GA和松弛型的NG为PAM的靶点进行有效碱基编辑。本团队曾在2019年成功开发出基于xCas9的另一款新型碱基编辑器（xCas9-pBE），本研究开发的xCas9n-CBE与之相比，不但能够拓展编辑xCas9-pBE不能编辑的NGCPAM位点，而且表现出更高的平均碱基编辑效率和更宽的编辑窗口。除上述两款新型碱基编辑器外，本团队还在2019年开发出基于SpCas9及其变体VQR、以及SaCas9变体SaKKH的多款新型碱基编辑器，实现了对PAM 为NAG、NGA、NNMRRT及NNKRGT靶点的C至T碱基替换。综合应用这些具有不同特点的碱基编辑器，可以更大范围地拓展作物基因组上基因组编辑的可靶向区域，具有很大的应用潜力。
玉米中心张成伟博士为本文第一作者，杨进孝为本文通讯作者。本研究得到北京学者（BSP041）项目和北京市自然科学基金（6204041）资助。玉米基因组编辑团队是2017年组建成立的，目前主要聚焦于碱基编辑、精确替换、组学编辑及其在玉米和水稻等作物中的高效应用。这是该团队自成立以来在国际学术期刊上发表的第8篇高水平研究论文。
日期：2020-12-22
