培养基的灭菌是菌种生产成败的关键，未经灭菌的培养基中存在着大量的微生物，常常导致菌种污染，给生产造成损失，目前菇农普遍采用的灭菌方法是常压蒸气灭菌。
常压蒸气灭菌的常压灭菌灶用砖砌成，选直径110厘米的铁锅，用砖砌高100厘米、直径120厘米的锅筒，内外用水泥抹光滑。
培养基装入灭菌锅后，用较厚的塑料膜和麻袋片把锅筒口包盖住，用绳子捆绑结实，然后用旺火猛烧，在最短的时间内将锅烧开。待塑料膜鼓气后成馒头状时，说明锅已烧开，灭菌从这时开始计时，要持续8-10小时，确保灭菌彻底，一些菇农往往在灭菌上麻痹大意，因杂菌污染严重导致制种失败。常压灭菌时要做到“三防止”，一要防止中途降温，中途不得不得停火，如锅内达不到100℃，在规定时间内则达不到灭菌的目的。二要防止烧干锅，在灭菌之前锅内要加足水，在灭菌过程中，如果锅内水量不足，要及时从注水口注水。三要防止存在灭菌死角，如锅底着火部位不均，锅筒口处仅从一端漏气等等都可能出现灭菌死角。
二、接种与培养
灭菌后的培养基可进行接种，接种就是将菌种移植到培养基上。从事接种的操作人员，必须树立严格的无菌观念，使操作者和接种工具处于严格的无菌状态。因此，必须对接种工具进行严格的灭菌，对操作环境进行彻底消毒，操作者的手和衣着也要消毒，严格遵守无菌操作规程。接种时要在接种箱内或接种室内进行。
接种时，先将接种箱或接种室内杂物清除干净，用2%来苏儿喷雾消毒。将待接种的培养基、菌种和所用工具放入接种箱或接种室工作台上，用福尔马林和高锰酸钾熏蒸接种箱、接种室至少半个小时，用量是每立方米空间用5克高锰酸钾，加10毫升甲醛，接种前用75%的酒精棉擦抹双手、母种试管或原种瓶外表，然后点燃酒精灯，进行操作。接种完毕，熄灭酒精灯，将已接种好的瓶或袋移至培养室培养。一般一支母种可扩繁原种4-5瓶，一瓶原种可扩繁栽培种40-50瓶或15-20袋。
培养室要保持清洁并调好温度、湿度和空气、光照等环境条件，菌种培养的适宜温度以20-25℃，空气的相对湿度控制在60%左右为宜。发菌期间要求暗光发菌，培养室要始终保持通风良好的环境条件，按此管理方法，菌种在40天左右就可长满瓶或袋。长满瓶（袋）的菌种如果不马上使用，要放在0-10℃以下的环境中，可保藏1-3个月。
