一、结核杆菌的培养基的配制1、网友ljksbs给出结核杆菌培养基配制的方法:
结核杆菌培养采用罗－琴培养基,为防止培养基干裂,可加入适量甘油,我们是在1600ml的培养基中加入甘油12ml.
罗－琴培养基成分:
磷酸二氢钾2.4g;一水硫酸镁0.24g;拘掾酸镁0.6g;天门冬素3.6g;2％孔雀绿水溶液20ml;蒸馏水600ml;马铃薯淀粉30g;甘油12ml;新鲜鸡蛋液1000ml.
具体配制方法如下:
1、加热上述重量的溶解磷酸盐,硫酸镁,拘掾酸镁,天门冬素和甘油于600ml蒸馏水中.
2、一边搅拌一边加入马铃薯淀粉,于沸水中水溶1小时,在置于56度水浴箱内1小时.
3、将新鲜鸡蛋洗净后,在75％乙醇中消毒30分钟,去除后点火烧掉鸡蛋外壳上的乙醇,无菌打破蛋壳,将蛋白和蛋黄收集于灭菌容器内,充分搅拌,无菌纱布过滤,在收集新鲜鸡蛋液1000ml;加入上述混合液中.
4、加入灭菌的2％孔雀绿水溶液,均匀混合,分装于灭菌的试管内,加塞封闭,斜置于血清凝固器内,85度1小时间歇灭菌2次.于冰箱保存备用.
二、结核杆菌的计数
1、网友benrong给出计数方案:
结核菌生长缓慢且难于培养,不适于用平板培养,一是易污染环境,二是培养时间长了,平板会很快干掉.因此结核菌的cfu测定不能象大肠菌那样采用平板菌落计数法.一般很少有人做结核菌的cfu计数,如果一定要做,可用Middlebrook7H9液体培养基依次稀释,再接种于罗氏斜面培养基或 Middlebrook7H10,计数可见到单菌落的培养斜面上的菌落数,计算出cfu.
一般斜面面积可达4~5平方厘米,只要稀释菌液中的活菌数足够少,就肯定可得到可目测出的单菌落数(n).假设每个稀释度菌液的体积为v1,接种体积为V2,则cfu/ml=n×V1×稀释倍数/V2.
已培养出的结核菌菌落,可用一玻璃试管,加几颗玻璃珠,1ml生理盐水,一起高压蒸汽灭菌.然后,挑取菌落到此试管中,振摇以获得均匀菌悬液,再稀释成所需麦氏浊度.还可将已分纯的细菌接种到7H9肉汤培养基培养,待菌生长后再根据你的需要稀释成一定麦氏浊度的菌液.因Middlebrook 7H9 brooth添加了OADC及吐温-80,不但营养丰富,而且细菌可呈均匀生长.
2、网友tb9981认为:
结核菌与一般细菌不一样,容易形成菌团,接种前应研磨均匀,制备1mg/ml菌悬液后用10倍稀释,如果没经验,多接几个稀释度,每个稀释度最少3 支,每支接种0.1ml,计算最后长满的不计算,可计数稀释度菌落就可以,一般合格培养基培养每毫克结核杆菌约1-2千万活菌.
如果第1次做,可以拿卡介苗(0.5mg/支)当对照(2-10百万cfu/mg),以确定你实验方法无误.
