【实验目的】 了解和掌握双向电泳技术,并学习用它来研究与DNA 复制相关的问题.
【实验原理】
DNA 分子有线状的,还有一些非线状的,如复制叉和重组DNA 结构.双向琼脂糖凝胶电泳技术就是被人们开发用以研究一些非线状DNA 分子的.双向琼脂糖凝胶电泳技术(2-D gel)实际上可分为两类：中性/中性双向凝胶电泳和中性/碱性双向凝胶电泳技术.它们的工作原理如下：
中性/中性双向凝胶电泳：非线状的DNA 分子在琼脂糖凝胶中的泳动行为和线状DNA 分子相比是不规则的.并且这种行为随着琼脂糖浓度或电压增加而加剧.而这正是中性/中性双向凝胶电泳的工作原理：在第一向中,样品在琼脂糖凝胶中以低琼脂 糖浓度、低电压的条件进行电泳,则DNA 分子主要根据其分子量大小被分离.在第二向中,则采用高浓度琼脂糖凝胶和较高电压条件,DNA 分子的分离则主要根据其形状.
中性/碱性双向凝胶电泳：此方法适合用来分析DNA 复制中间体.这些中间体包括各种长度的新链部分.在第一向中与中性/中性双向凝胶电泳一样采用中性pH,将DNA分子按其分子量大小分开.在第二向中,采 用碱性pH,使DNA 复制中间体中新链部分释放,并按其长度分离,如同在普通琼脂糖凝胶中一样.
双向凝胶电泳在分析DNA 结构方面,最大的特点就是简便易行.它已成功地应用于酵母DNA 复制起点的定位、确定酵母复制叉阻抑点以及DNA 复制抑制剂机理的研究等.但双向电泳也有一定的问题,如得到的图像与理论上的图像不吻合,而且很难解释.如果电泳条件不当,还会产生假象.本实验所介绍的 实验步骤适用于分析3kb～5 kb的复制型的DNA 限制性片段.
【仪器、材料与试剂】
1、琼脂糖粉(Ⅱ型,MediumEEO,Sigma).
2、TBE 贮存液(450mmol/L Tris-硼酸盐,10mmol/L EDTA)：1L 体积,54g Tris 碱(Fluka),27.5g 硼酸(Fluka),20mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0；Serva),室温保存.
3、6×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝(Bio-Rad)0.25%,二甲苯青FF(Bio-Rad),15%的Ficoll(400 型,pHarmacia)溶于水中,室温保存.
4、碱性缓冲液(40mmol/L NaOH 和1mmol/L EDTA)：1L 体积,8mL 5mol/LNaOH(Fluka),2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0,Serva),需新鲜配制.
5、EB 贮存液(10mg/mL)：1g EB(Sigma),100mL 去离子水,避光容器4℃保存.
【实验步骤】
中性/中性双向凝胶电泳
第一向电泳：(低琼脂糖浓度和低电压)
1、用胶带封好一个胶模,将其放在一个水平的台面上(最好用水平仪检测过).放入样品梳(梳齿底部与玻璃板之间距离为2mm).
2、取适量的琼脂糖粉末和TBE 电泳缓冲液(0.4%琼脂糖,45mmol/Ltris-硼酸盐和1mmol/L 的EDTA)配制凝胶,加热时不时地轻摇玻璃瓶或锥形瓶,确保琼脂糖全部溶解.
3、冷却该溶液至60℃,然后倒入胶模中,让其在室温下静置凝固30min～1h.完全凝固后小心移去梳子和胶带,把胶板移至电泳槽内.
4、向电泳槽内注入相同的TBE 缓冲液(45mmol/Ltris-硼酸盐,1mmol/L 的EDTA)直至缓冲液刚好没过凝胶面.
5、取一定量的DNA 样品与6×上样缓冲液混合,注入缓冲液中加样孔内.盖上电泳槽,把电源连在电极上,让DNA 向正极泳动,电压为1V/cm(由两电极之间的距离测定).
6、电泳24h 后,取出胶板.用TBE 缓冲液和0.3μg/mL EB 贮存液配成的染液染色.
7、紫外光下显色,并切下含有DNA 样品的胶带.
第二向电泳：(高琼脂糖浓度、高电压)
8、准备另外一个胶模,但不带梳子.把模子放在一个水平台面上(最好用水平仪检测过),操作要在4℃冷室内进行.
9、制备好含有EB 的TBE 缓冲液(0.3μg/mL EB,45mmol/L Tris-硼酸盐,lmmol/LEDTA)并冷却至4℃.
10、按第一向电泳的方法,配制琼脂糖凝胶,只不过琼脂糖浓度为1.0%.
11、冷却琼脂糖凝胶溶液至约70℃,加入EB 至浓度为0.3μg/mL.
12、把第一向电泳中切下的样品凝胶带水平放置在第二个胶板的顶端,然后倒入含有1.0%琼脂糖凝胶溶液,并使之凝固(都在4℃下进行).
13、移去胶带,并把胶板放到电泳槽内,向槽内注入冷却至4℃的含有0.3μg/mL EB的TBE 缓冲液,使缓冲液超过胶面约1mm.放置循环水泵的导管于电泳槽两极间缓冲液内,使电泳液在两极间循环.
14、 盖上电泳槽并接好电源.DNA将向正极泳动.电压4V/cm,4℃下电泳14h,电泳结束后,将胶板从电泳槽内取出.如果DNA样品已被标记(如32P) 可直接进行放射自显影.若样品没有被标记,可采用杂交的方法.放射自显影可在室温下进行,也可在-70℃下用增敏屏进行曝光.没有标记的样品可用 Southern-杂交或碱性转移法将样品DNA转至尼龙膜上,用同位素标记探针杂交而进行检测.
中性/碱双向电泳
第一向电泳：中性/碱性双向电泳的第一向同中性/中性双向电泳的第一向电泳步骤几乎完全相同.
第二向电泳：(0.8%琼脂糖,NaOH-EDTA 缓冲液,电压1V/cm)
1、制备一个胶模不带梳子,并把它放于4℃冷室内的水平台面上(最好用水平仪测过).
2、配制NaOH-EDTA 缓冲液(40mmol/L NaOH,1mmol/L EDTA)冷却到4℃.
3、把从第一向电泳中切下的样品带置于碱性缓冲液中,室温下平衡至少30min.之后将平衡好的样品带平行放置在胶模的一端,温度为4℃.
4、配制琼脂糖凝胶,浓度为0.8%.
5、将琼脂糖溶液冷却至60℃后,加入NaOH 和EDTA 至浓度分别为40mmol/L 和1mmol/L,将配好的胶液倒入模子中,让样品带和胶在4℃下静置凝固.
6、去掉胶模上的胶带,把胶板放入电泳槽内.加入碱性缓冲液至超过胶面约1mm.把循环水泵导管置于两极间缓冲液中,并使缓冲液在电泳槽中循环.
7、盖上电泳槽,连好电源.DNA 分子将向正极泳动(红色接线柱).电压1V/cm,4℃下至少24h.
8、中性/碱性双向电泳的样品检测基本相同于中性/中性双向电泳的方法.
【注意事项】
1、DNA 片段的大小对双向电泳条件的选择是一个关键因素,本实验所用例子为3kb～5kb.如果DNA 片段超过5kb,双向电泳的条件需要相应地改变.
2、加样量也是一个关键步骤,理想的加样量是300ng～1000ng.
3、第一向电泳中,凝胶的长度应至少达到25cm,才能保证更好地分离.0.4%的琼脂糖凝胶比较脆,取梳子时要格外小心.
4、TBE 浓度最初采用90mmol/L Tris-硼酸盐和2mmol/L EDTA.但现在通常所用的浓度仅为其一半即可提供所需缓冲能力.
5、在整个中性/中性双向电泳过程中,要使用同一批TBE 贮存液,以保证相同的离子强度和pH.
6、在双向电泳过程中,可在样品一端加合适的DNA 分子量标记物,帮助分析样品的大小和位置.在第一、第二向中,该标记物都起重要作用,尤其是在第二向中,作用更大.
