控制菌检验方法验证

控制菌检验方法验证

建立药品的微生物限度检查时，进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

1.1.验证用菌株

大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】或同等有效的

金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】或同等有效的

乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】或同等有效的

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】或同等有效的

验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

1.2.菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10mL营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；

分别取培养液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100CFU的菌悬液。

1.3. 阴性菌对照组

设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。

1.4.试验组

常规法

【大肠埃希菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。

【大肠菌群】取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1mL 、0.1g或0.1mL、含供试品0.001g或0.001mL的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检查SOP》大肠菌群项下规定检查。

【沙门菌】 取供试品10g或10mL，直接或处理后接种至适量（不少于200mL）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌 10～100CFU，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

【铜绿假单胞菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100CFU，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

【金黄色葡萄球菌】取相当于1g或1mL供试品的供试液至100mL胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100CFU，阴性菌对照加入大肠埃希菌 10～100CFU，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》金黄色葡萄球菌项下规定检查。

培养基稀释法

供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器体积限制，一般放大到500mL或1000mL，本法适用于抑菌作用不强的样品。

薄膜过滤法

采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

离心沉淀集菌法

取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1mL液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中度抑菌作用的样品。

中和法

在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。

1.5.结果判断

至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。