在微生物鉴定中，革兰氏染色应该是最初接触的一种区分细菌的实验方法。通过革兰氏染色鉴定后，区分出革兰氏阳性菌和阴性菌，凭借结果以作后续的鉴定分离细菌。可以说，革兰氏染色在微生物研究过程中，是一个应该掌握的技术。
1.细菌的细胞壁
要了解革兰氏染色的原理，先了解细菌的细胞壁：
细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，能够固定细胞外形和保护细胞不受损伤，其主要功能包括：
特定的抗原性以及抵御抗生素、噬菌体的能力；
固定细胞外形以及提高机械强度，避免外力的损伤；
是细胞生长、分裂和运动（主要是有鞭毛的细菌）的必需构造；
阻挡大分子物质（对生命活动有危害或潜在危害的物质）进入细胞。
2.细菌细胞壁的差异
细菌细胞壁除了含有肽聚糖，还有其它组分，这些组分是革兰氏阳性菌和阴性菌所不同的。
革兰氏阳性菌的细胞壁主要由60%-95%的肽聚糖组成，还有10%-30%磷壁酸；阴性菌的细胞壁与阳性菌细胞壁相比较，虽然厚度相对薄，但是成分复杂，除了肽聚糖外，还有一层由脂多糖、磷脂和若干外膜蛋白组成的外膜结构。
革兰氏阳性菌与阴性菌细胞壁的主要差异如下：
肽聚糖层：阳性菌的较厚且层次多，阴性菌的为单层且薄；
外膜：只有阴性菌存在外膜结构，包括了脂多糖和类脂；
磷壁酸：多数阳性菌都有磷壁酸，阴性菌不存在磷壁酸；
对机械力的抗性：阳性菌抗机械力的能力强于阴性菌；
抗溶菌酶的能力：阴性菌抗溶菌酶的能力优于阳性菌。
3.革兰氏染色的机制
革兰氏染色以细菌细胞壁化学成分的差异引起脱色能力的不同为基础，即，细菌能否将染色剂阻碍在细胞壁中的原理，进行区分阳性菌和阴性菌，其结果为：阳性菌的细胞壁能够将染色剂结晶紫阻留而染成紫色；阴性菌的细胞壁不能将染色剂阻留，经过复染后形成红色。
经过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成结晶紫与碘的复合物，该复合物不溶于水。阳性菌因为细胞壁较厚、肽聚糖层多和交联致密，且不含类脂，当乙醇/丙酮进行脱色处理时，肽聚糖网层结构因失水导致网孔变小，结晶紫与碘的复合物就被阻留在细胞壁中。
阴性菌因为细胞壁较薄，且外膜层类脂物质含量高，受到乙醇/丙酮作用，细胞壁结构发生改变，外膜的类脂溶解，肽聚糖网层不能够将结晶紫与碘的复合物阻留，重新恢复为无色的状态，然后经过沙黄等红色染剂的复染形成红色。
4.革兰氏染色的操作
革兰氏染色的基本步骤如下：
固定：涂片干后加热固定，火焰固定时涂片膜朝上，以中等速度越过火焰3次，或使用乙醇/甲醇固定；
初染：滴加结晶紫染液，1分钟，清水洗去染液；
媒染：加碘液，1分钟，水洗；
脱色：加脱色液，摇动10-30秒，至无紫色脱落，水洗；
复染：加复染液，30秒，水洗；
镜检：涂片干后镜检。
