菌落总数的测定！不看你就out啦！

1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。
2、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义 。

1、菌落总数

食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时等）培养后，所得每mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。

一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。在GB 4789.2-2022的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。

菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

2、菌落总数测定的卫生学意义：

（1）食品本身的新鲜程度

（2）加工、贮存运输过程中是否受到污染--卫生质量

（3）卫生学指标：食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。

3、2022版国家标准的主要变动：

三、流程：

拍击式均质

方便：只需购置一次性无菌均质袋，无须提前准备无菌容器；省去手工操作。

快捷：1-2分钟内帮您完成均质工作。

科学：均质过程不会产生高温。但是不适合均质坚硬样品，如鱼骨。 

稀释液——磷酸盐缓冲液or生理盐水。

如果样品pH较低，建议使用磷酸盐缓冲液，以免影响培养基的凝胶强度。

培养基——平板计数琼脂。

关于均质器使用效果和对检测结果的影响，有不同的报道：

1、不同食品样品采用不同的均质方法，测试结果不同。

2、不同的均质方式对金黄色葡萄球菌和霉菌、酵母菌的检测的影响也不同。

（二）、样品稀释：

1、样品的稀释。

2、制备好样品匀液后,用1mol/L氢氧化钠或1 mol/L盐酸调节pH至6.6~7.2。

3、接种。

4、培养。

琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。

（三）、培养注意事项：

根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择1~3个稀释度。加入样品时要注意外来的污染。

培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。（倾注的温度：一般46~50℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡。厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。

为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在15min内倾注培养基。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。

1、培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。

2、为控制污染，在实验过程中，应在工作台上打开一块琼脂平板，其暴露时间应与检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长时间相当，然后与检样一同培养，以了解检样在操作过程中有无受到来自外界的污染。培养温度:每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。

3、食品：36±１℃，48±2h 。

4、饮用水：36±１℃，48h 。

5、水产品：30±１℃，72±3h。(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。

（四）、对照试验的要点：

1、检样的稀释液中往往带有食品颗粒，在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照，不经培养，置4℃环境放置，在计数时用于对照。

2、或可选用TTC营养琼脂作培养基。

菌落计数的要点：

1、如果高稀释度平板上的菌落数比低稀释度平板上的菌落数高，则说明检验过程中可能出现差错或样品中含抑菌物质，这样的结果不可用于结果报告。

2、如果平板上出现链状菌落，菌落间没有明显的界限，这可能是琼脂与检样混匀时，一个细菌块被分散所造成的。一条链作为一个菌落计。若培养过程中遭遇昆虫侵入，在昆虫爬行过的地方也会出现链状菌落，也不应分开计数。

3、如果平板上菌落太多，不能计数时，不能用多不可计作报告。应在最高稀释度平板上任意选取2个1cm²的面积，计算菌落数，除2求出每cm²面积内平均菌落数，乘以63.6(皿底面积cm²数)（这样说明选择的稀释度不合适，生产企业自检自控可以这样报告，正式的报告不能这样报告）。

4、如果检样是微生物类制剂（酸牛奶、酵母制酸性饮料等），在进行菌落计数时应将有关微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。 

5、每个样品从开始稀释到倾注最后一个平板的时间不得超过15min，目的是为了使菌落能在平板上均匀分布，否则，时间放长了，样液可能由于干燥而贴在平板上，倾注琼脂后不易摇开，容易产生片状菌落，影响菌落计数。另外，琼脂凝固后不要在室温长时间放置，应及时将平皿倒置培养，可避免菌落的蔓延生长。

6、检验过程中应用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检验过程中应在工作台上打开一块空白的平板计数琼脂，其暴露时间应与检验时间相当，以了解检样在检验过程中有无受到来自空气的污染。

7、检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌发生混淆，可以作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃冰箱放置，以便在计数时用作对照。另外也可以在已熔化而保温在45℃水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1mL0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。