军团菌是一种在自然界中很常见的细菌，可以引起以发热和肺炎。是潜伏在我们身边的“杀手”，它的部分症状和新冠肺炎较相似，且易发展为重症，病死率为5%～30%。军团菌侵入人体后，进攻凶猛，7天内就可导致患者死亡，患者死亡大都因为呼吸衰竭，其次为休克和急性肾功能衰竭等。
军团菌病主要的感染途径是人吸入被污染的气溶胶。
气溶胶来源包括空调冷却塔、冷热水系统、加湿器、温泉等。感染可通过吸入受污染的气溶胶而发生，特别是易感的住院病人。大多数健康人群感染军团菌后，表现为无症状或症状很轻的一过性感染，50岁以上人群、吸烟者、以及有慢性肺部疾病、免疫功能低下、肿瘤、基础疾病等人群感染后发病风险较高。军团菌病潜伏期一般为2-10天。一旦患病，病情常较严重。如治疗延迟或治疗不当，其病死率可高达15%-20%。军团菌病患者可采用红霉素、阿奇霉素等抗生素进行治疗。
目前空调冷却水、喷泉水等非饮用水中军团菌污染问题已引起各国研究者的广泛关注，而饮用水中军团菌污染的相关研究较少。但近年来饮用水系统被军团菌污染事件时有发生，特别是2020年受新冠疫情的影响，多数建筑长期封闭导致供水系统长时间水流停滞，为军团菌的生长繁殖提供有利条件。
我国原卫生部于2006年颁布了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》的行业标准，依据该标准，各级疾控部门和监督部门相继开展了公共场所集中空调嗜肺军团菌的监测、评价和调查工作。2013年，中华人民共和国国家标准《公共场所卫生检验方法》(GB/T 18204.5—2013)出台，其中，第5部分介绍了集中空调冷凝水、冷却水中嗜肺军团菌的检测方法。上述行业标准与国家标准对集中空调冷凝水、冷却水中嗜肺军团菌的检测方法基本相同，且与欧美等国家监测方法相似，即通过对集中空调冷凝水、冷却水进行过滤、洗脱、酸处理、热处理后进行细菌培养。分离培养法是目前国际通用检测军团菌的“金标准”，适用于各种环境水体。
近些年出现了多种新的嗜肺军团菌定量检测方法。其中，酶底物法作为一种同时适用于饮用水和非饮用水的嗜肺军团菌检测方法备受关注。酶底物法作为嗜肺军团菌定量检测方法，是嗜肺军团菌利用酶底物试剂中氨基酸、维生素和其他营养物质迅速生长和增殖，其代谢产物与试剂发生反应使溶液显褐色，基于最可能数(most probable number，MPN)方法对样本中嗜肺军团菌进行定量分析。
今天我们先学习一下国家标准《公共场所卫生检验方法》(GB/T 18204.5—2013)中空调冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检测方法：
一
原理
样品经培养在 GVPC 琼脂平板上生成典型菌落，并在 BCYE 琼脂平板上生长而在 BCYE-CYE 琼脂平板不生长，进一步经生化实验和血清学实验鉴定确认的菌落为嗜肺军团菌。
二
仪器设备
2.1.平皿：90mm。
2.2.CO2 培养箱：35℃ ~37℃
2.3.紫外灯:波长360nm士2nn.
2.4.滤膜过滤器
2.5.滤膜：孔径 0.22μm~0.45μm。
2.6.真空泵
2.7.离心机
2.8.涡旋振荡器
2.9.普通光学显微镜、荧光显微镜
2.10.水浴箱
2.11.广口采样瓶：玻璃或聚乙烯材料，磨口，容积 500 mL。
三
试剂和培养基
3.1.GVPC琼脂平板
3.2.BCYE琼脂平板
3.3.BCYE-CYE琼脂平板
3.4.革兰氏染色液
3.5.马尿酸盐生化反应管
3.6.军团菌分型血清试剂
3.7.硫代硫酸钠标准溶液[c(Na2S203)-- 0.1 mol/L]
四
采样
4.1将采样广口瓶(2.11) 用前灭菌。
4.2每瓶中加人Na2S2O3(c =0.l mol/L)0.3 mL~0.5 mL,中和样品中的氧化物。
4.3水样采集位置：冷却水采样点设置在距塔壁20cm、液面下10cm 处，冷凝水采样点设置在排水管或冷凝水盘处。
4.4 每个采样点依无菌操作取水样约 500 mL。
4.5 采集的样品 2d 内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不应超过 15d。
五
检验步骤
5.1样品的沉淀或离心:如有杂质可静置沉淀或1000 r/min离心lmin去除。
5.2样品的过滤:将经沉淀或离心的样品通过滤膜(2.5)过滤,取下滤膜置于15mL灭菌水中,充分洗脱﹐备用。
5.3样品的热处理:取1 mL洗脱样品﹐置50℃水浴(2.10)加热30min。
5.4样品的酸处理:取5 mL洗脱样品,调pH至2.2,轻轻摇匀,放置5 min。
5.5样品的接种:取洗脱样品(5.2),热处理样品(5.3)及酸处理样品(5.4)各0.l mL,分别接种GVPC平板。
5.6样品的培养:将接种平板静置于CO2培养箱(2.2)中,温度为35℃~37℃,CO2浓度为2.5%。无CO2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时,反转平板,孵育10d,注意保湿。
5.7菌落观察:军团菌生长缓慢,易被其他菌掩盖﹐从孵育第3d开始每天在显微镜(2.9)上观察。军团菌的菌落颜色多样,通常呈白色、灰色、蓝色或紫色﹐也能显深褐色、灰绿色、深红色;菌落整齐,表面光滑﹐呈典型毛玻璃状,在紫外灯下,部分菌落有荧光。
5.8菌落验证:从平皿上挑取个可疑菌落﹐接种BCYE琼脂平板和BCYE-CYE琼脂平板,35 ℃~37℃培养2 d,凡在BCYE琼脂平板上生长而在BCYE-CYE琼脂平板上不生长的则为军团菌菌落。
5.9菌型确定:应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养:氧化酶(一/弱＋),硝酸盐还原(一),尿素酶(一),明胶液化(＋),水解马尿酸。血清学实验:用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
