金黄色葡萄球菌主要污染营养丰高且含较多水分的食品，如乳类及乳制品、肉类、剩饭等，其次为熟肉类，偶见鱼类及其制品、蛋制品等。部分金黄色葡萄球菌能够引发包括由于肠道毒素的消化吸收引发的胃肠炎等各种疾病综合症。
检测原理
一系列产品稀释液被接种到选择性鉴别琼脂培养基中，产生典型的金黄色葡萄球菌菌落，金黄色葡萄球菌菌落通过凝固酶反应确定。每克样品的金黄色葡萄球菌数量以凝固酶阳性菌落的比例为基础而计算得到。
初步鉴定
金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm-3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
确证鉴定
1.染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约0.5μm-1μm。
2 血浆凝固酶试验:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面,36℃±1℃培养18h-24h。
取新鲜配制兔血浆0.5mL,放入小试管中,再加入 BHI培养物0.2mL-0.3mL,振荡摇匀,置36℃±1℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培养18h~48h,重复试验。
结果与报告
1.结果判定:符合初步鉴定、确证鉴定的可判定为金黄色葡萄球菌。
2.结果报告:在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
典型菌落计数和确认
1.金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2 mm-3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。
2.选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU-200CFU 之间的平板,计数典型菌落数。
3.从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验;同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h-24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。
结果计算
1.若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU-200CFU 之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。
2.若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。
3.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。
4.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20CFU-200CFU范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。
5.若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU-200CFU 之间,按式(2)计算。
6.计算公式 式(1):
式中:
T ———样品中金黄色葡萄球菌菌落数;
A ———某一稀释度典型菌落的总数;
B ———某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;
C ———某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;
d ———稀释因子。
式(2):
式中:
T ———样品中金黄色葡萄球菌菌落数;
A1 ———第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;
B1 ———第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;
C1 ———第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;
A2 ———第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;
B2 ———第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;
C2 ———第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;
1.1———计算系数;
d ———稀释因子(第一稀释度)。
报告
根据公式计算结果,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌数,以 CFU/g(mL)表示;
如T 值为 0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
