缓冲液的选择
当分离酸性或碱性样品时，通常需加入一定量的缓冲盐，缓冲盐的浓度及类型如何确定？
1、缓冲盐的浓度
缓冲盐的浓度对离子样品保留值的影响通常较小，浓度一般为10-50mmol/l。
2、缓冲盐的类型
缓冲盐类型的选择，主要取决于所需要的缓冲能力，在反向色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型的样品的保留随pH改变而明显变化。通常在pH2到4条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高。因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。缓冲盐溶液的pH值越接近其pka，缓冲能力越强。一般缓冲盐溶液的pH值应在其pka±1的范围内。
3、缓冲盐的离子缔合（反离子对液相色谱行为的影响与理论解析）
如酸性条件下分离碱性化合物，加入NH4CL，碱性物质离子与反离子相互作用的平衡导致它们相互的溶剂化并形成相关复合物离子：
[碱]+[Cl]− = [碱+ -- Cl−]，在低pH时，碱性化合物被完成质子化，溶液阴离子（如CL-）在流动相中破坏了碱性物周围的水分子并增加其疏水性，导致样品保留时间增加，当盐浓度大于50mM时，保留时间略有下降[4]，这可能是饱和反离子CI-引起的离子相互作用的屏蔽作用。此外还可以添加硫酸钠或者高氯酸钠等改变碱性化合物的保留。
4.缓冲盐的其它性质
缓冲盐的溶解性、挥发性和稳定性（可能与设备、样品和或色谱柱发生作用）对某些分离也很重要。如磷酸盐，在含有高浓度有机相（70%以上），可能会析出；一些缓冲剂放置即降解，贮存或长期使用后其紫外吸收会增加（如：TFA、三乙胺）；一些缓冲盐能通过形成离子对，对样品发生作用（如三氟醋酸缓冲剂与阳离子样品，三乙胺与阴离子样品等）；挥发性的缓冲盐如碳酸胺、甲酸铵、醋酸铵等可应用于蒸发光散射、质谱的检测。
5.pH的选择
通常进行分析方法开发时要求远离化合物的pKa，是远离主成分的pKa还是远离待测杂质的pKa？如果在pKa附件是否方法就不能用？
是各杂质的pKa，只不过平时经常是通过主成分的pKa来代表各杂质，制定远离pKa±2。pKa为化合物的酸碱平衡常数，即在该pH条件下，该化合物处于分子离子状态，分子状态化合物，疏水性较强，即色谱柱保留时间较长；离子状态化合物亲水性较强，及色谱柱保留时间较短。制定的流动相pH在待测组分pKa±2以内，有时也是可用的，只不过可能存在各杂质的色谱行为对pH较敏感，尤其是保留时间。会不会出现裂缝或出现双峰的现象，个人认为通常不会，因为分子离子间也存在相互作用力，除非分子疏水作用、离子的亲水作用大于分子离子间的作用力，才有可能裂缝/出双峰。
6.通常开发方法建议在低pH进行
大多数反相柱都可以在pH2-8条件下使用，强酸条件下硅胶基质发生水解，造成塌陷。高pH 条件下硅胶会溶解，当然硅胶柱经特殊处理，如硅甲基嵌入、增加亚乙基桥等可以增强填料的耐酸碱性。对于一般酸碱化合物的分离，建议先从酸性条件起步，无法达到目的后再向中性、碱性条件进行尝试（应注意色谱柱的耐受性）。
7.调节pH的应用及注意事项
1、当pH改变时，有些酸性或碱性样品的吸光度会发生改变（因为紫外吸收会有溶剂效应，红移或蓝移），故在不同pH值时运行的已知化合物无法保持其峰大小不变。分析方法开发时，通常采用“混标”进行分离度摸索，无法采用峰高进行标识时，检测采用全波长进行峰的定位（采用光电二极管阵列检测器）。
2、pH变化可导致离子化合物的k值发生10倍或更大的变化，根据需要对流动项（B%）进行调整。
3、在分离一组酸碱官能团相似的化合物时，通过改变pH来优化分离度是个不错的选择，但需权衡方法的抗干扰性，如pH的微小变化（小于0.1单位）导致峰保留的变化（pH接近一种或多种化合物的pKa），可通过精确量取缓冲剂组成（重量或体积）以精密控制pH值，而不是用pH计将缓冲剂滴定至理想的pH，日常方法开发，尽量避免该条件，方法耐受性非常差，风险极大。
4、偏中性条件硅羟基对弱碱性化合物的影响，对于碱性化合物会与其形成吸附，导致拖尾，解决办法分别为更换色谱柱、用高浓度的缓冲盐（>10mM），选择被硅羟基牢固保留的缓冲盐阳离子（Na+<k+<nh4+<三乙胺+）。< p=""></k+<nh4+<三乙胺+）。<>
5、偏中性条件硅羟基对电负性强的化合物的影响（比溶剂出峰还靠前），一个案例，有一杂质在中性色谱条件下，在溶剂前出峰，调整该方法流动相至酸性条件，该杂质在色谱柱上有保留。
6、在混合磷酸三乙胺或醋酸三乙胺时，应先加入磷酸盐或醋酸盐然后再加三乙胺，因为纯三乙胺可能不溶于水。在用醋酸铵/甲酸铵控制pH时，由于该盐吸湿性较强，需确定不同摩尔浓度对分离的影响。确保方法的适用性。
甲醇/乙腈的选择
反向色谱最常用的甲醇或乙腈，甲醇的截至波长为205nm，乙腈的截至波长为190nm，乙腈水系统由于其粘度非常低，塔板数较高而柱压较低，是流动相的最佳选择。通常40%的乙腈具有与50%的甲醇相似的溶剂强度。
基于溶剂不同的选择性，甲醇为类质子溶剂，可形成氢键，对于分离酸碱或电负性强的化合物有提高选择性，乙腈为极性分子，其碳氮三键含有未成键电子，能与含有空轨道的化合物结合，则与甲醇有着不同的化合物选择性。有时单用ACN或MEOH可能会达不到理想的分离效果，在流动相同时使用ACN和MEOH可改变选择性以获得较好的分离效果。简言之，在改变分离选择性的时候，甲醇细调，乙腈粗调。主要是为了调整流动相的粘度和强度，使得分离效果和选择性有所改善。
离子对的选择
适用范围：使用液相色谱法分析电离能力比较强的样品时，样品在反相色谱柱上的保留时间很短或者根本不保留，这时要加入相应的离子对试剂，将分析物上的离子进行结合，形成在柱子上有保留的分子。
作用原理：加入离子对试剂后，它可以与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，疏水性增加而在色谱柱上有保留行为。离子对类似于胶黏剂，一头以离子吸引住待测物（也是离子），另一头以碳链与固定性作用，从而把待测物保持在固定相上。
试剂选择：离子对分为正离子对和负离子对，分析酸性样品（确切的说应该是作用基团）用正离子对试剂，分析碱性样品用负离子对试剂。正离子对试剂可以吸附带负电荷的样品组分，负离子对试剂反之。戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠.....十二烷基磺酸钠属于负离子对试剂；四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、四丁基氢氧化铵等属于正离子对试剂。离子对要考虑样品体系的复杂性和干扰物的特性，先用碳链短的，浓度尽量低，降低对色谱柱填料的影响，同时流动相的pH值尽可能低以确保离子化程度。
离子对试剂的浓度：通过改变被固定相吸附的离子对试剂的多少，有可能将保留过程由反相改变为离子交换色谱。这种改变是通过改变流动相中的试剂的浓度实现的。同常浓度范围从几毫摩到几十毫摩不等。
注意事项：三乙胺、醋酸铵也起到部分离子对试剂的作用，使用离子对的色谱柱建议专柱专用。
等度与梯度的选择
梯度洗脱用于方法建立，对于组分未知的样品进行HPLC方法建立时，即使最终分离拟用等度洗脱仍需先采用梯度洗脱进行方法开发。目的为确定以下几项：
1、初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续试验选择等度或梯度提供必要的依据。
2、若等度洗脱是最好选择，初始梯度试验可为进一步试验提供最佳%B的估算值。
3、初始梯度洗脱实验可以使整体样品分离更好、更快。
4、初始梯度洗脱遗漏早与晚流出的低浓度组分的可能性较小。
5、初始梯度通常为线性梯度（全梯度），如5—100%B，根据杂质情况，1.5梯度/min或5梯度/min，进行试验。
梯度洗脱时由于改性剂在水相的吸收与有机相中的吸收不同，导致基线漂移，可通过混合流动相的方式进行改善。
通常含量常采用等度方法，有关检测建议采用梯度的方法，在进行含量方法确定时，需评估潜在杂质对主峰的影响及方法的运行时间。
