一、菌总数的念和测定意义
菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物,它是由数以万计的相同细菌聚集而成的,故又有细菌集落之称。
菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(ml)或表面积(clni)内,、所含能于某种固体培养上,在一定条件下培养后所生成的细菌菌落的总数。菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记,也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态.以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。
二、菌落总数测定的几项说明
1.菌落总数的测定。是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后,每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20%),因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数,厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长,有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制,因此所得结果,只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2.鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个,成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在,因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块,也可以来源于单个细胞,因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数,而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数( colony forming units,CFU)报告之。3.每种细菌都有它一定的生理特性,培养时,应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、pH、需氧性质等)去满足其要求,才能分别将各种细菌都培养出来。因此,要得到较全面的细菌菌落总数,应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上,并培养在不同条件下,如温度,氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定,都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
三、菌落总数的测定
测定食品中菌落总数时,是将食品检样做成几个不同的10倍递增稀释液,然后从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与营养琼脂相混合,经培养后,按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数,并再根据检样的稀释倍数,计算出每g或ml样品中所含细菌菌落的总数。
四、菌落总数测定中的一些要求和规定
为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定。
(一)所用器皿及稀释液
1.检验中所用玻璃器皿,如培养皿,吸管、试管等必须是完全灭菌的,并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。
2.用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时,要追加对照平板,以判定是空白稀释液,用于倾注平皿的培养基,还是平皿吸管或空气可能存在的污染。
3.检样的稀释液虽可用灭菌盐水或蒸馏水,但以用磷酸缓冲盐水特别是0.1%蛋白胨水为合适,因蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用,不会因为在稀释过程中使食品检样中原已受损伤的细菌细胞导死亡。如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释,则宜采用蒸馏水。
(二)检样稀释
1.检样稀释时,应无菌称取(或量取)有代表性的样品25g(或ml)剪碎放于含有225ml灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇作成1:10的稀释液。
如肉、鱼等固体样品,最好剪细于灭菌乳钵内与稀释液研匀,或与稀释液同置于灭菌均质器杯中，以8000-10000rpm速度搅拌1分钟,使做成均匀的1:10稀释液。
2.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计,将上述1:10的检样稀释液再做成几个适当的10倍递增稀释液。即取1:10稀释液1ml与9ml稀释液混和做成1:100的稀释液,然后依次递増稀释,做成1:1000、1:10000等稀释液。注意每递增稀释一次,必须另换1支1ml灭菌吸管,这样所得检样的稀释倍数方为准确。
3.从吸管筒内取出灭吸管时,不要将吸管尖端碰着其他仍留在容器内的吸管的外露部分；而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时,也不要触及瓶口及试管口的外侧部分:因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。
4.在作10倍递増稀释中,吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时,应先高于吸管刻度,然后提起吸管尖端离开液面,将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度,这样取样较准确,而且在吸管从稀释液内取出时不会有多余的液体粘附于管外。
5.当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时,应小心沿管壁加入,不要触及管内稀释液,以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。
（三）平板接种与培养
1.将稀释液加至灭菌平皿时，应根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液加入皿内（从皿侧加入，不要揭去皿盖），最后将吸管直立使液体流毕，并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出，而不要吹出。每个稀释度应做2个平皿。
2.用于傾注平皿的营养琼脂应预先加热使融化，并保温于45土1℃恒温水浴中待用。倾注平皿时,每皿内倾入的1.5ml，最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。
3.为了防止细菌增殖及产生片状菌落,在检液加入平皿后,应在20分钟内向皿内倾入琼脂,并立即使其与琼脂混和均匀。
4.检样与琼脂混和时,可将皿底在平面上先向一个方向旋转,然后再向相反的方向旋转,以使充分混匀。旋转中应加小心,不要使混和物到皿边的上方。为了保证混和均匀,而不溅及皿边的上方,可使用自动平皿旋转仪,直接将加有检样的平皿放在旋转位上(可同时放4只平皿),加入琼脂后,开动电钮,在数十秒钟内即可自动左右旋转而使皿内的检样与琼脂混合均匀。
5.皿内琼脂凝固后,不要长久放置,然后翻转培养;而应于琼脂凝固后,在数分钟内将平皿翻转予以培养,这样可避免菌落蔓延生长。必要时,可先将皿打开倒置(皿底向上)于温箱内经15~60分钟使琼脂表面干燥后,再将皿底移至盖内倒置于温箱内培养。这样可以阻止运动性强的变形杆菌属、假单胞菌属和芽胞杆菌属中一些菌株在琼脂表面扩展生长。
6.为了控制污染,在取样进行检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴露的时间,应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴落的最长的时间相当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养,以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
7.培养温度,应根据食品种类而定。肉、乳、蛋类食品用37℃培养,水产品用30℃培养。培养时间为48±2小时。其他食品,如清凉饮料,调味品,糖果、糕点、果脯、酒类(主要为发酵酒)、豆制品和酱腌菜均系用37℃ 24±2小时培养。培养温度和时间之所以有这种不同的区分,是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时,分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据。水产品因来自淡水或海水,水底温度较低,因而制定水产品细菌方面的卫生标准时,用30℃作为培养的温度。
(四)对照试验
1.加入平皿内的检样稀释液(特别是10-1的稀释液),有时带有食品颗粒,在这种情况下,为了避免与细菌菌落发生混淆,可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿,不经培养,而于4℃环境中放置,以便在计数检样菌落时用作对照。
2.为了防止检样中食品颗粒与菌落混淆，也可在已融化而保温于45℃水浴内的琼脂中，按每100ml加1ml 0.5%TTC水溶液。培养后，如食品颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落，配好的TTC溶液，应先用来与不加TTC的做对照，以观察其对计数是否有不利的作用（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后，在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲艏（formazan），使菌落呈现红色。
（五）菌落计数
1.从温箱内取出平皿进行菌落计数时,应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。平行试验的2个平板与菌落数应该接近,不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比,即检样稀释倍数越大,菌落数越低,稀释倍数越小，菌落数越高。
2.计数菌落时,应选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定的标准。1个稀释度使用两个平板,应采用两个平板平均数：如其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。如在一个稀释度的两个平板中,一个平板的菌落数在30-300之间,另一个大于300或小于30时,则以菌落数在30~300间的平板作为计数的标准。
3.菌落计数所得结果,可分别按以下几种不同情况作报告。
(1)若1个稀释度的平均菌落数在30-300之间,则将该菌落数乘其稀释倍数报告之。
(2）若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30~300之间・则视二者之比如何来决定。若其比值小于2,应报告其平均数,例如2:46000/29500=1.6＜2,故报告为:(46000+29500)/2=37750或3.8×104。若大于2,则报告其中较小的数字,如3:6000/27100=2.2＞2，故报告为:27100或2.7×104。若等于2,亦报告其中较小的数字,如4:3000/1500=2,故报告为:1500或1.5×103。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，如报告为:313×108=313000或3.1×105。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以选择的稀释度。
(5)若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1(＜1)乘以最低稀释倍数报告之,如报告为1×10,或＜10。
(6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间,其中一部分大于300或小于30时,则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
4.注意事项
(1)如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高,则系检验工作中发生的差错,属实验室事故。此外,也可能因抑菌剂混入样品中所致,均不可用作检样计数报告的依据。
(2)如果平板上出现链状菌落,菌落之间没有明显的界限,这是在琼脂与检样混合时,一个细菌块被分散所造成。一条链作为一个菌落计,如有来源不同的几条链,每条链作为一个菌落计,不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外,如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入,在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落,也不应分开来数。
(3)如果所有平板上都有菌落密布,不要用多不可计作报告,而应在稀释度最大的平板上,任意数其中2cm2个,除2求出每cm2内平均菌落数乘以皿底面积63.6cm2数,再乘其稀释倍数作报告。例如10-1~10-3稀释度的所有平板上均菌落密布,而在10-3稀释的平板上任数2个cm2内的菌落数是60个,皿底直径为9cm,则该检样每g(或ml)中“估计”菌落数为:60/2×63.6×1000=19080001.9×106。63.6cm2数系按皿底直径为9cm时计算而得,即:(9/2)2×3.14=63.6:如所用平皿的皿底直径不是9cm,则可按其直径的实际cm数代人圆面积公式求出。
(5)检样如系微生物类制剂(如酸牛乳、酵母制酸性饮料),则平板计数中应相应地将有关微生物(乳酸杆菌、酵母菌)排除,不可并入检样的菌落总数内作报告,一般在校正检样的pH7.6后,再进行稀释和培养,此类嗜酸性微生物往往即不易生长，并可用革兰氏染色鉴别。染色鉴别时，要用不矫正pH的检样做成相同稀释度的稀释液培养所成的菌落涂片染色作对照，用以辨别。酵母菌卵圆形，远比细菌大，大小为2~5×5~30um，革兰氏阳性着色，乳酸杆菌在24小时内，于普通营养琼脂平板上在有氧条件下培养，通常是不生长的。
（五）报告方式
1、当检样的菌落数为1-100时,按实有数报告:大于100时,只记录左面头两位数字(用两位有效数字作报告,可避免产生虚假的精确概念)。左面第三位数字则用四舍五入法计算,从第二位数字之后都记为0，为了缩短数字后面的0数,也可用10的指数来表示,例如菌落数为37750时,即可写成3.8×105。
2.检样的菌落数如系从菌落密布的平板上按比例计算而求得,报告结果时,应在菌落数前加上“估计”二字。
3.检样为固体,用重量法取样检验时,以g为单位报告其菌落数；检样为液体,用容量法取样检验时,以ml为单位报告其菌落数；如检样为样品表面的涂擦液,则应以cm2为单位报告其菌落数。4.如检样为液体,在两个平皿内所加1ml未经稀释的检样(原液)培养中,均无细菌集落生成,则报告为1ml检样内未有菌落生长,或1ml检样内菌落数＜1。
五、特殊的方法
(一)平板表面涂布法
将营养琼脂制成平板,经50℃ 1-2小时或35℃ 18-20小时干燥后,于其上滴加检样稀释液0.2ml,用L棒涂布于整个平板的表面,放置片刻(约10分钟),将平板翻转,移至36土1℃温箱内培养24土2小时(水产品用30℃培养48土2小时),取出,按前述方式进行菌落计数,然后乘以5(由0.2ml换算为1ml),再乘以样品稀释的倍数,即得每g或ml检样所含菌落数。
此法较上述倾注法为优,因菌落生长在表面,便于识别和检查其形态,虽检样中带有食品颗粒也不会发生混淆,同时还可使细菌不必遭受融化琼脂的热力,不致因此而使菌细胞受到损伤而不生长,从而可避免由于检验操作中的不良因素而使检样中细菌菌落数降低。但是本法取样量较倾注法为少(仅倾注法的五分之一），代表性将受到一定的影响。
(二)平板表面点滴法与涂布法相似。所不同者,只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0.025ml)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在平板背面用标记笔划成四个区域),每个区域滴1滴,每个稀释度滴两个区域,作为平行试验。滴加后,将平板放平片刻(约5~10分钟),然后翻转平板,如前移入温箱内培养6~8小时后进行计数,将所得菌落数乘以40(由0.025ml換算为1ml),再乘以样品稀释的倍数，即得每g或ml检样所含菌落数。本法具有快速、节省人力物力，但此法取样量少，代表性可能受到影响。
