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革兰氏染色技巧

   2020-08-17 448
核心提示:何为革兰氏染色:革兰氏染色是细菌鉴别染色方法中最常使用的,染色结果可区分革兰氏阳性菌及阴性菌,是鉴定细菌最重要的分类依据
 何为革兰氏染色:

革兰氏染色是细菌鉴别染色方法中最常使用的,染色结果可区分革兰氏阳性菌及阴性菌,是鉴定细菌最重要的分类依据之一。


染色有4种试剂:

 

初染剂:结晶紫,步骤中最先使用的试剂,把细菌染成蓝紫色。

媒染剂:革兰氏碘液,可与初染剂结合,形成结晶紫及碘复合物(CV-I),加强染料颜色的固定。

脱色剂:95%乙醇,因阳性菌与阴性菌细胞壁构造不同,而有不同的脱色反应。

复染剂:番红,被上述步骤脱色的细菌,就会被这此试剂染成红色。


革兰氏染色原理:

革兰氏染色法是由丹麦微生物学家汉斯-克理斯蒂安-革兰(Hans Christian Gram)于1884年发明,至今仍为鉴别细菌之最重要方法。依据革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性以及革兰氏阴性两类。其染色原理推测与此两类细菌之细胞壁结构有重大关系。


说法有二

其一为:革兰氏阴性细菌的细胞壁含脂量高,酒精脱色时会将部份脂质萃取出来,而使细胞壁结构松动,通透性增加,故结晶紫-碘复合体(CV-I)被带出细菌体外而无色。革兰氏阳性细菌的细胞壁几乎不含脂质,酒精甚至会使细胞壁脱水,故结构更加致密,结晶紫-碘复合体就被留在细菌体内。

其二为:酒精处理时,会使细菌的细胞壁肽聚醣(peptidoglycan)空隙缩小。革兰氏阳性细菌之细胞壁肽聚醣较厚,而革兰氏阴性细菌较薄,所以造成结晶紫-碘复合体离开革兰氏阴性细菌的机会较大。故以酒精脱色后,取用红色的番红进行复染,此时无色的革兰氏阴性细菌就会变成粉红色,而原本已染上蓝色的革兰氏阳性细菌就会变成紫色。


革兰氏染色注意事项:

不论何种染色法,最基本都要先熟习抹片的制作,抹片应厚薄适中,且宜匀而薄,细菌量不宜太多

染色时,脱色步骤可影响结果正确与否,脱色过度会使初染剂流失,使革兰氏阳性细菌变为革兰氏阴性细菌的颜色:但脱色不足,则无法完全去除CV-I复合物,结果使革兰氏阴性细菌呈现革兰氏阳性细菌的颜色。此步骤非常需要经验的累积。

每种染剂之间,以蒸馏水或无菌水充分清洗,以除去剩余的染液。

宜使用18-24小时培养的新鲜菌落,因老化的细菌易失去保留初染剂的能力,而显示出错误的结果,可能部分染成红色,部分呈紫色。

建议每次染色时,可以带品管玻片一起染色,确定染色时间及步骤正确。






 
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