革兰氏染色是细菌鉴别染色方法中最常使用的，染色结果可区分革兰氏阳性菌及阴性菌，是鉴定细菌最重要的分类依据之一。
初染剂：结晶紫，步骤中最先使用的试剂，把细菌染成蓝紫色。
媒染剂：革兰氏碘液，可与初染剂结合，形成结晶紫及碘复合物(CV-I)，加强染料颜色的固定。
脱色剂：95%乙醇，因阳性菌与阴性菌细胞壁构造不同，而有不同的脱色反应。
复染剂：番红，被上述步骤脱色的细菌，就会被这此试剂染成红色。
革兰氏染色法是由丹麦微生物学家汉斯-克理斯蒂安-革兰(Hans Christian Gram)于1884年发明，至今仍为鉴别细菌之最重要方法。依据革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性以及革兰氏阴性两类。其染色原理推测与此两类细菌之细胞壁结构有重大关系。
其一为：革兰氏阴性细菌的细胞壁含脂量高，酒精脱色时会将部份脂质萃取出来，而使细胞壁结构松动，通透性增加，故结晶紫-碘复合体(CV-I)被带出细菌体外而无色。革兰氏阳性细菌的细胞壁几乎不含脂质，酒精甚至会使细胞壁脱水，故结构更加致密，结晶紫-碘复合体就被留在细菌体内。
其二为：酒精处理时，会使细菌的细胞壁肽聚醣(peptidoglycan)空隙缩小。革兰氏阳性细菌之细胞壁肽聚醣较厚，而革兰氏阴性细菌较薄，所以造成结晶紫-碘复合体离开革兰氏阴性细菌的机会较大。故以酒精脱色后，取用红色的番红进行复染，此时无色的革兰氏阴性细菌就会变成粉红色，而原本已染上蓝色的革兰氏阳性细菌就会变成紫色。
不论何种染色法，最基本都要先熟习抹片的制作，抹片应厚薄适中，且宜匀而薄，细菌量不宜太多
染色时，脱色步骤可影响结果正确与否，脱色过度会使初染剂流失，使革兰氏阳性细菌变为革兰氏阴性细菌的颜色：但脱色不足，则无法完全去除CV-I复合物，结果使革兰氏阴性细菌呈现革兰氏阳性细菌的颜色。此步骤非常需要经验的累积。
每种染剂之间，以蒸馏水或无菌水充分清洗，以除去剩余的染液。
宜使用18-24小时培养的新鲜菌落，因老化的细菌易失去保留初染剂的能力，而显示出错误的结果，可能部分染成红色，部分呈紫色。
建议每次染色时，可以带品管玻片一起染色，确定染色时间及步骤正确。
