微生物检验中的两种新型“武器”大PK

 

16SrRNA基因测序和宏基因组测序是现在微生物检验中的两大新型武器，它们在微生物研究中共同发挥着极大的作用，都是研究微生物的重要方法。但是二者又有什么不同呢?接下来将做一个简单说明。

定义

16SrRNA基因测序：就是指从微生物样本中提取16SrRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切探针杂交获得16SrRNA基因序列信息再与16SrRNA数据库中的序列或其它数据进行比较，确定其在进化树中的位置从而鉴定可能存在的微生物种类。


16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。细菌核糖体RNA（rRNA）有三种类型：5SrRNA（120bp）、16SrRNA（约1540bp）和23SrRNA（约2900bp）。


5SrRNA基因序列较短，包含的遗传信息较少，不适于细菌种类的分析鉴定；23SrRNA基因的序列太长，且其碱基的突变率较高，不适于鉴定亲缘关系较远的细菌种类；16SrRNA普遍存在于原核细胞中，且含量较高、拷贝数较多（占细菌RNA总量的80%以上），便于获取模板，功能同源性高，遗传信息量适中，适于作为细菌多样性分析的标准。


宏基因组测序（metagenomicsSequencing）：是对环境样品中全部微生物的总DNA（也称宏基因组：metagenomic）进行高通量测序，主要研究微生物种群结构、基因功能活性、微生物之间的相互协作关系以及微生物与环境之间的关系。宏基因组测序研究摆脱了微生物分离纯培养的限制，扩展了微生物资源的利用空间，为微生物群落的研究提供了有效工具。

研究对象不同

16SrRNA基因测序研究对象为分离纯化后微生物。（想要进行基因测序必须要有培养以后微生物菌落）


宏基因组测序研究对象为样本。（可以是各种检验样本，不需要微生物的分离培养）

应用领域的不同

宏基因组测序在微生物领域应用主要包括：
●环境微生物多样性；
●基因挖掘；
●改造工程菌；
●疾病关联分析；
●药物开发。


16SrRNA基因测序在微生物领域应用主要包括：
●微生物多样性；
●微生物种群分析；
●重要基因发现；
●遗传物质在微生物之间或微生物与非生物环境之间的关系。


二者虽然在应用领域有所不同，但是在整个研究过程是相辅相成的，可以互相补充验证，从而达到最终的研究目的。整个研究如下图：

测序原理不同

16SrDNA基因存在于所有细菌的基因组中，具有高度的保守性。该序列包含9个高变区和10个保守区（如下图），通过对某一段高变区序列（V4区或V3-V4区）进行PCR扩增后进行测序，得到1500bp左右的序列。其中，V4-V5区其特异性好，数据库信息全，是细菌多样性分析注释的最佳选择。


宏基因组测序则是将微生物基因组DNA随机打断成500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，再通过组装的方式，将小片段拼接成较长的序列。



 

物种鉴定程度不同

16SrRNA测序得到的序列很多情况鉴定不到种水平。宏基因组测序则能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平。对于16SrRNA测序而言，任何一个高变区或几个高变区，尽管具有很高的特异性，但是某些物种（尤其是分类水平较低的种水平）在这些高变区可能非常相近，能够区分它们的特异性片段可能不在扩增区域内。宏基因组测序通过对微生物基因组随机打断，并通过组装将小片段拼接成较长的序列。因此，在物种鉴定过程中，宏基因组测序具有较高的优势。但是宏基因组测序的弊端就在于DNA的纯化提取过程较难实现。

总结：
通常情况下，在微生态研究中，建议同时结合宏基因组测序和16SrRNA测序两种技术手段，可以更高效、更准确地研究微生物群落组成结构、多样性以及功能情况。其实在实际工作中我们可以根据自己所需进行选择测序方法，例如实验室无法鉴定的细菌或是研究细菌是否具有同源性可以16SrRNA测序方法。如果是有感染但无法获得病原菌或者某一种细菌是否和疾病有关系的研究就需要宏基因组测序。