出血性大肠菌及检验

　　肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。

　　肠出血性大肠杆菌感染可引起轻度腹泻、出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合症（HUS），血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等。其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。

　　1982年美国首次报道了由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势。1996年在日本发生的EHEC O157:H7的暴发流行，引起出血性腹泻，先后波及30多个都、府、县，感染近万人，并造成12人死亡，引起了全世界的关注。此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。日本、加拿大及瑞士等国已将EHEC O157:H7列为必须报告的传染病，予以高度重视。我国于1988年首次分离到EHEC O157:H7，从已有的流行病调查资料来看，我国亦存在EHEC的散发病例，但尚未有暴发流行的报道。

二、流行病学

　　EHEC O157:H7引起的感染有明显的季节性，多发生于夏秋两季，7-8月为发病高峰。在地区分布上，多发生于发达国家，主要以散发性感染为主。在年龄分布上，儿童与老年人的发病率明显高于其他年龄组，且并发HUS和TTP的机率较高。最易分离到 O157:H7的年龄为5-9岁（0.9%）和50-59岁（0.89%）。农场动物，尤其是反刍动物，构成EHEC O157:H7在世界范围内的主要贮存宿主。O157:H7在牛中的流行报告范围为0.1-16%；羊、猪、鸡、马、鹿、鸽子、海鸥等动物均可能为EHEC的携带者。EHEC的感染可形成直接传播（动物→人，人→人），也可以通过间接传播（食物、水源→人）。食源性的EHEC感染中，牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中， 牛肉是最主要的传播载体。

　　EHEC O157:H7的感染剂量极低。潜伏期为3-10天，病程2-9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可发热或不发热。部分患者可发展为HUS、TTP等， 严重者可导致死亡。

三、生物学特征

　　EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性，即O157:NM。EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；耐低温，能在冰箱内长期生存；在自然界的水中可存活数周至数月；不耐热，75℃ 1分钟即被灭活；对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。EHEC 的最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长。

　　EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌 基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义（详见表2）。EHEC O157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）产生荧光，即MUG阴性。

　　EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验；后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。

　　EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成。编码VT的基因位于噬菌体上，可缺失而不产生VT。

四、EHEC O157:H7的检验

1、培养基制备：

　　改良EC新生霉素增菌肉汤 （mEC）

　　EC肉汤灭菌后添加20mg/mL过滤除菌的新生霉素，使终浓度为20μg/mL。

　　改良山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）

　　山梨醇麦康凯琼脂加入过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液，使终浓度2.5mg/L，头孢克污，使终浓度为0.05mg/L。

　　MUG-LST肉汤

　　LST肉汤中添加4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG），使终浓度为0.1g/L。

2、增菌培养

　　秤取25克样品放入225mL mEC中，均质。于41±1℃培养18-24小时。

3、分离

　　将mEC肉汤培养物10倍递增稀释。从10-4，10-5，10-6稀释度，各取0.1mL涂布于TC-SMAC平板。于36±1℃培养18~24小时。可疑 EHEC O157:H7菌落扁平，透明或半透明，边缘光滑，呈淡褐色中心，直径约2mm。

4、鉴定

　　挑取TC-SMAC上的可疑菌落，接种MUG-LST，于36±1℃培养18~24小时，出现产气，且无荧光者，分离到普通营养琼脂。

　　对纯菌落用EHEC O157:H7标准血清或胶乳凝集试剂作凝集试验，必要时进行生化试验。

　　在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100℃水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。

　　EHEC O157:H7检验程序图解

检样25g

↓

　　　　　　mEC225mL → VIDAS快速筛选

　　↓41±1℃，18-24h

10^-4，10^-5，10^-6稀释度涂布TC-SMAC

↓36±1℃，18-24h

挑取5-10个可疑菌落接种MUG-LST

↓36±1℃，18-24h

MUG阴性培养物转种普通营养琼脂

↓ 　　　　↓

生化反应鉴定 　　　血清凝集鉴定

　　　　　　　或

　　　　　　　　　胶乳凝集试验

　　用上述方法在样品中分离获得的纯菌落，经抗E.coli O157:H7标准血清或EHEC O157:H7胶乳凝集测试为阳性者，报告检出肠出血性大肠杆菌O157:H7。

　　如需要进一步检测Vero毒素基因的存在，可通过接种Vero细胞或Hela细胞，观察细胞病变进行判定，或可使用基因探针检测和聚合酶链反应（PCR）检测法。（参见FDA细菌分析手册第8版）

表1：EHEC O157:H7部分生化反应特性

表2： EHEC O157:H7与大肠埃希氏菌有鉴别意义的生化特性

[注] NT为未检测，表内数字为阳性率。

五、控制

　　适宜的蒸煮，适当的储存温度，个人卫生教育，防止粪便污染动物胴体是控制出血性大肠杆菌污染的主要措施。