作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种:
1、传统方法
常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同.
细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观察项目选择与之相对应的染色方法,目前常用的染色方法包括革兰氏染色法、美蓝染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆萨染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.尽量挑选对数生长期的细菌进行染色观察,此时的细菌生长处于幼期,利于观察,因为一些陈旧细菌的染色结果会有变化,如本为革兰氏阳性菌经过长期搁置后染色结果可能为革兰氏阴性.同时细菌培养时要注意培养基的挑选,一些细菌的特殊结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表达是需要在特定的培养基上才能正常发育,有的细菌如炭疽在一般的培养基上不形成荚膜,只在动物体内形成明显的荚膜,所以需先接种实验动物后用病料进行涂片镜检.在镜检时观察细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽胞和荚胞等.
形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异,表现出不同的生长特性.通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果.如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等.
血清型鉴定是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法.抗原的特异性程度又存在于属间细菌所共有的共同抗原,这种抗原的存在,能表明其属性.另一类特异性抗原只存在于特定的种、型,是确定细菌种、型的重要依据.通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定.
细菌毒力的测定,病原菌侵入机体能否引起疾病与其本身的毒力、侵入机体的数量和侵入部位有关.不同的病原菌或同种细菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定时间内,能使一定条件的某种动物半数死亡或感染需要的最小细菌数或毒素量.毒力测定在菌种鉴定过程中可用于鉴别一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式进行计算.
2、仪器自动化鉴定
随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用,微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段.近20年来,一系列商品化自动鉴定系统相继推出,并在应用中取得理想效果,如VITEK系统、MIDl系统、BIOLOG系统、 SENSITl．TRE系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等.下面以BIOLOG微生物鉴定系统为例,简述微生物自动鉴定系统的工作原理:BIOLOG微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统,该系统主要根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种碳源的利用情况进行鉴定.细菌利用碳源进行呼吸时,会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色,从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”,通过纤维光学读取设备——读数仪来读取颜色变化(分为“自动”和“人工”两种读取方式),由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹图谱”与数据库相比较,可以在瞬间得到鉴定结果,确定所分析的菌株的属名或种名.以BIOLOG系统6．01版数据库为例,包含了革兰氏阴性好氧菌524种、革兰氏阳性好气菌341种、厌氧菌361种、酵母菌267种、丝状真菌(含部分酵母菌)619种以及几种特殊的致病菌,目前这个数据库已进行更新.利用微生物快速系统进行细菌鉴定,能节省时间,但由于其在数据比对过程中记入一些非特异性的阳性反应孔,会造成偶然误差,从而引起个别鉴定结果不稳定,另外此类仪器本身及其耗材价格均较高.
3、分子生物学鉴定
分子生物学鉴定目前比较流行的主要是核酸检测技术,包括基因测序、指纹图谱技术、基因探针技术、聚合酶链反应(PCR)、GC含量测定等.PCR和核酸杂交单独或结合在仪器已经形成比较经典的核酸检测技术,目前这两者已经得到了较大范围的推广和应用.
下面将简单介绍几种核酸检测技术的原理:
DNA的G+C含量测定法
此法是根据细菌的DNA中G+C含量的特异性来进行细菌鉴定,通过熔解温度(Tm)法或浮力密度法测定细菌DNA中G+C的含量,通过对比来鉴定细菌.
扩增片段长度多态性(AFLP)分析
此法是一种测定基因组限制性片段的DNA指纹技术,通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图谱.与其他DNA指纹技术相比有其独特的优点:可用于各种大小不同的基因组的指纹分析,为研究细菌属乃至株间的亲缘关系提供一个有效手段;具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择,调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目;由于适用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳,因而重复性好,分辨率高;AFLP不仅仅是简单的指纹技术,而且可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究.
限制性片段长度多态性(RFLP)分析
其原理是用限制性内切酶将细菌基因组DNA进行切割,之后在琼脂糖凝胶上电泳分离,以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性.RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定.
随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,又称为随意引物PCR(AP—PCR)
它是一种DNA指纹多态性分析技术,其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不同,因而用一组人为设计的核苷酸作为引物,通过PCR随机扩增可产生物种特异性的DNA带谱.
16S rRNA鉴定
细菌的核糖体RNA(rRNA)基因高度保守且进化速度缓慢,在漫长的进化过程中保留了rRNA基因结构和功能的同源性,在微生物染色体上可存在多个拷贝,以rRNA基因片段为探针可检出含有rRNA基因的DNA片段.分析杂交后得到的rRNA指纹图,为菌种定型和近缘菌株的鉴定提供了一种新技术.针对rRNA基因的核糖体分型可成功地区分多个菌种的相关菌株,因此该技术也被广泛称作核糖体分型技术.原核生物含有23S、16S和5S三种 rRNA,其大小分别约为3000、1500和120个碱基.其中作为小亚单位核糖体RNA的16S rRNA的大小最适合于核糖体分型.一般完成l6S rRNA序列测定后,在GenBank中与已知的序列进行BLAST分析,从而得出鉴定结果.
4、小结
一般来说,对于微生物的检测或鉴定应当至少使用三种指标同时进行验证.传统的分类鉴定需要测定的项目众多,工作程序繁琐,耗时长.在某些时候可以配合分子生物学的方法进行鉴定,如在进行菌株的血清型鉴定时,对于某些国内资源稀缺的菌株定型血清,而进口定型血清价格昂贵,国内可以开发分子生物学分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物学方法鉴定菌株血清型时,经常会遇到有一些菌株的血清型种类繁多,目前还无法通过简单的核酸测定完成血清定型工作,如大肠杆菌,仅O抗原就有上百种血清型,对于这种情况在使用血清进行定型的同时,还需要继续深入研究其分型技术.目前市场上的微生物自动鉴定系统虽然基本上都通过了相关权威组织的认可,在细菌快速鉴定或初步鉴定中起到了一定的作用,但如前所述,其稳定性尚存在一定问题,同样需要配合其他方法来相互印证,从而完成细菌鉴定工作.
总而言之,更多地使用传统与现代相结合以及不断发掘新的鉴定方法才能更好地完善菌种保藏过程中的细菌鉴定工作.
摘自《中国兽药杂志》.-2009,(3).-50~52
