一、目的要求: 了解原生质体融合技术的原理.
学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术.
二、基本原理:
原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径,但有些微生物不适于采用这些途径,从而使育种工作受到一定的限制.1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上,有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段.由于它具有许多特殊优点,所以,目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用.
(一) 原生质体融合的优点:
1、克服种属间杂交的“不育性”,可以进行远缘杂交.由于用酶解除去细胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物,皆可发生原生质体融合,产生重组子.
2、基因重组频率高,重组类型多.原生质体融合时,由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用,使细胞相互聚集,可以提高基因重组率.原生质体融合后,两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触,发生多位点的交换,从而产生各种各样的基因组合,获得多种类型的重组子.
3、可将由其他育种方法获得的优良性状,经原生质体融合而组合到一个菌株中.
4、存在着两个以上亲株同时参与融合,可形成多种性状的融合子.
(二) 原生质体融合步骤:
1、选择亲本:选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本.
2、制备原生质体:经溶菌酶除去细胞壁,释放出原生质体,并置高渗液中维持其稳定.
3、促融合:聚乙二醇加入到原生质体以促进融合.聚乙二醇为一种表面活性剂,能强制性的促进原生质体融合.在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时,更能促进融合.
4、原生质体再生:原生质体已失去细胞壁,虽有生物活性,但在普通培养基上不生长,必须涂布在再生培养基上,使之再生.
5、检出融合子:利用选择培养基上的遗传标记,确定是否为融合子.
6、融合子筛选:产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型,前者性能不稳定,要选出性能稳定的单倍重组体,反复筛选出生产性能良好的融合子.
(三) 原生质体再生率和融合率计算
三、实验材料:
(一) 菌种:
枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro-
(二) 培养基(见附录):
1、完全培养基(CM,液体);
2、完全培养基(CM,固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂;
3、基本培养基(MM);
4、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂,75 Pa 灭菌20min;
5、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖,1.0％纯化琼脂作上层平板,2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min.
6、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用).
(三) 缓冲液:
1、0.1mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液.
2、高渗缓冲液:于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇.
(四) 原生质体稳定液(SMM):
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸,调pH 6.5.
(五) 促融合剂:
40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液.
(六) 溶菌酶液:
酶粉酶活为4000 u/g,用SMM 溶液配制,终浓度为2 mg/mL,过滤除菌备用.
(七)器皿:
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、烧杯、离心管、吸管、显微镜、台式离心机、721 比色计、细菌过滤器.
四、实验内容:
(一) 原生质体的制备:
1、培养枯草芽孢杆菌:
取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中,36℃振荡培养14 h,各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中,36℃振荡培养 3 h,使细胞生长进入对数前期,各加入25 u/mL 青霉素,使其终浓度为0.3 u/mL,继续振荡培养2 h.
2、收集细胞:
各取菌液10 mL,4000 r/min 离心10 min,弃上清液,将菌体悬浮于磷酸缓冲液中,离心.如此洗涤两次,将菌体悬浮10 mL SMM 中,每mL 约含108～109 活菌为宜.
3、总菌数测定:
各取菌液0.5 mL,用生理盐水稀释,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基,36℃培养24 h 后计数.此为未经酶处理的总菌数.
4、脱壁:
二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶浓度为100 ug/mL,混匀后于36℃水浴保温处理30 min,定时取样,镜检观察原生质体形成情况,当95%以上细胞变成球状原生质体时,用4000 r/min 离心10 min,弃上清液,用高渗缓冲液洗涤除酶,然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中.立即进行剩余菌数的测定.
5、剩余菌数测定:
取0.5 mL 上述原生质体悬液,用无菌水稀释,使原生质体裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL,涂布于完全培养基平板上,36℃培养24～48 h,生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞.
计算酶处理后剩余细胞数,并分别计算二亲株的原生质体形成率.原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数
(二) 原生质体再生:
用双层培养法,先倒再生补充基本固体培养基(SMR)作底层,取0.5 mL 原生质体悬液,用SMM作适当稀释,取10-3、10-4、10-5 稀释液各1mL,加入底层平板培养基的中央,再倒入上层再生补充半固体培养基混匀,36℃培养48 h.分别计算二亲株的原生质体的再生率,并计算其平均数.
(三) 原生质体融合:
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合,放置5 min 后,2500 r/min 离心10 min,弃上清液.于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀,再加入1.8 mL PEG 溶液,轻轻摇匀,置36℃水浴保温处理2 min,2500 r/min 离心10 min,收集菌体,将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中.
(四) 检出融合子:
取0.5 mL 融合液,用SMM 液作适当稀释,取0.1 mL 菌液与灭菌并冷却至50℃的再生补充基本培养基软琼脂中混匀,迅速倾入底层为再生补充基本培养基的平板上,36℃培养2 d,捡出融合子,转接传代,并进行计数,计算融合率.
(五) 融合子的筛选:
挑选遗传标记稳定的融合子,凡是在再生补充基本培养基平板上长出的菌落,初步认为是融合子,可接入到酪蛋白培养基平板上,再挑选蛋白酶活性高于亲本的融合 子.由于原生质体融合后会出现两种情况:一种是真正的融合,即产生杂核二倍体或单倍重组体,另一种只发生质配,而无核配,形成异核体.两者都能在再生基本 培养基平板上形成菌落,但前者稳定,而后者则不稳定.故在传代中将会分离为亲本类型.所以要获得真正融合子,必须进行几代的分离、纯化和选择.
附录 细菌原生质体融合试验用培养基
1、完全培养基(CM):
蛋白胨 1 g
葡萄糖 1 g
酵母粉 0.5 g
牛肉膏 0.5 g
NaCl 0.5 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 灭菌20 min.
如需配制固体完全培养基时,则需在上述液体培养基中加入2％琼脂.
2、基本培养基(MM):
葡萄糖 0.5 g
(NH4)2SO4 0.2 g
柠檬酸钠 0.1 g
K2HPO4·3H2O 1.4 g
KH2PO4 0.6 g
MgSO4·7H2O 0.02 g
蒸馏水 100 mL
纯化琼脂 2 g
pH 7.0
100 Pa 灭菌20 min.
3、高渗再生培养基(CMR):
蛋白胨 1 g
葡萄糖 0.5 g
酵母粉 0.5 g
牛肉膏 0.5 g
NaCl 0.5 g
蔗糖 0.5 mol/L
MgCl2 20 mmol/L
纯化琼脂 2 g
pH 7.0
100 Pa 灭菌20 min.
如配上层固体培养基,需在上述液体培养基中加入0.6％琼脂.如需配底层固体培养基,则需加入2％琼脂.
4、补充基本培养基(SM):
在基本培养基中加入20 ug/mL 腺漂吟及2％纯化琼脂.
70Pa 灭菌20 mm.
5、再生补充基本培养基(SMR):
在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖及2％纯化琼脂.
70 Pa 灭菌 20 min.
6、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用):
Na2HPO4·12H2O 0.13 g
KH2PO4 0.036 g
NaCl 0.01 g
ZnSO4·7H2O 0.002 g
CaCl2·2H2O 0.0002 g
酪素 0.4 g
酪素水解氨基酸 0.005 g
琼脂 1.5～2 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 灭菌20 min.
7、0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0、pH 7.0):
K2HPO4 相对分子质量＝174.18,0.1 mol/L 溶液为17.4g/L,称取17.4 g K2HPO4,溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL.
KH2PO4 相对分子质量＝136.09,0.1 mool/L 溶液为13.6 g,称取13.6 g KH2PO4, 溶解于蒸馏水中,定容至1000mL.
蒸馏水 100 mL
